橄欖果提取物對(duì)捆蹄抗氧化及抑菌作用研究

張迎陽(yáng)，胡云青，鄒平，李麗娟，王宇

1(常州大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 常州,213164) 2(北京二商健力食品科技有限公司，北京,100000)

捆蹄作為我國(guó)傳統(tǒng)肉制品歷史悠久且加工過(guò)程精細(xì)，在全國(guó)范圍內(nèi)享譽(yù)盛名[1]；其加工原料為豬蹄髈肉及其他調(diào)味料，具有原料廉價(jià)、食用方便的特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[2]。近年來(lái)，隨著消費(fèi)者生活水平的提高，消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)捆蹄的要求也逐漸增加，主要表現(xiàn)為在豐富產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)，消費(fèi)者對(duì)捆蹄的食用品質(zhì)也提出了更高的要求[3]。但是，由于捆蹄產(chǎn)品脂質(zhì)含量高、水分活度大及腌制工藝等因素容易導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化及微生物超標(biāo)等，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)[4-6]。因此，調(diào)控捆蹄脂質(zhì)氧化及微生物生長(zhǎng)，以適應(yīng)現(xiàn)代消費(fèi)理念，對(duì)促進(jìn)高溝捆蹄的發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用。橄欖果提取物是抗氧化和抑菌作用兼?zhèn)涞奶烊辉蟍7-8]。研究表明，橄欖果提取物中含有大量的酚類(單酚類、酚酸類、黃酮類、芪類)、三萜類、VC、胡蘿卜素等[9-11]，具有與合成抗氧化劑相當(dāng)?shù)目寡趸饔眉癉PPH自由基清除能力等，能顯著降低油脂中的氫過(guò)氧化物(hydroperoxide, HPOD)及丙二醛含量等[12-13]。另有研究表明，橄欖果提取物對(duì)食品中細(xì)菌、霉菌、酵母菌等均具有顯著的抑制作用，具有抗菌消炎、抗毒解毒的功效[14-15]。目前，橄欖果提取物的研究主要集中于成分分析、有效成分提取及體外作用探索方面[16-18]，在食品尤其是傳統(tǒng)肉制品中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以捆蹄為主要產(chǎn)品，分析不同橄欖果提取物添加量對(duì)捆蹄腌制及貯藏過(guò)程中的抗氧化、抑菌的效果及對(duì)捆蹄品質(zhì)的影響，以期為捆蹄及傳統(tǒng)肉制品的抗氧化及抑菌提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

豬后蹄肉(同批豬肉，豬齡11個(gè)月)，淮安蘇食肉品有限公司；橄欖果提取物,上海一基生物試劑有限公司；食鹽、香辛料及調(diào)味料均為高溝市售；生化試劑如硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)等,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Beckman Allegra 64R冷凍離心機(jī),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；2300型Kjeltec 101-O-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SPX-250C型恒溫恒濕箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；IKA T18 basic型高速勻漿機(jī),美國(guó)Beckman Coulter公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì),日本島津公司；CR-400便攜式色差儀,日本Konica Minolta公司；TA.XTPlus物性測(cè)試儀,英國(guó)Stable Micro System。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

捆蹄加工工藝如下：

原料肉→清洗切碎→修整→腌制→捆扎→蒸煮→冷卻包裝

具體工藝加工點(diǎn)：腌制，將配置好的香辛料及調(diào)味料等與碎肉混勻(對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組所采用的基本配方一致：每1 kg肉中添加大料粉5 g、花椒粉5 g、胡椒粉3 g、食鹽40 g、雞精20 g)，在所需的溫度條件下腌制；捆扎，將腌制好的原料肉用腸衣包裹，用長(zhǎng)約20 cm經(jīng)蒸煮消毒過(guò)的麥草繩將包裹好的捆蹄先扎緊(間距約2 cm)成圓形蹄髈形狀(捆蹄直徑約4 cm)。在100 ℃蒸煮鍋中煮制0.5 h后將溫度降至90 ℃繼續(xù)蒸煮0.5 h，蒸煮完后靜止2 h，出鍋冷卻包裝。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.2.1工藝流程，分別在捆蹄腌制階段添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、100、200、300 mg/kg的橄欖果提取物，分析不同添加量的橄欖果提取物對(duì)捆蹄在4 ℃腌制1 d和貯藏7、14、21、28 d時(shí)的抗氧化(羰基值、POV值、TBARS值)、抑菌(菌落總數(shù)、酵母菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌)及其他品質(zhì)特性(色差、質(zhì)構(gòu))。

1.2.3 方法測(cè)定

(1)羰基值測(cè)定[19]：沿樣品切面中切除20 g左右的肉，剔除肌筋及可見(jiàn)脂肪，絞碎混勻后，再精確稱取5.000 g樣品加入pH值6.5的磷酸緩沖液10 mL(含0.6 mol/L的NaCl)于高速勻漿機(jī)中勻漿2次，各30 s。取2份勻漿液0.2 mL于試管中，并且加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA溶液，將上述溶液于12 000 r/min條件下冷凍離心5 min，棄去上清液。在其中1份沉淀中加入1 mL 2 mol/L的HCl溶液，另1份加入1 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%DNPH的2 mol/L的HCl溶液，混勻后在20 ℃條件下反應(yīng)1 h。然后再分別往上述2種溶液加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸(TCA)溶液，并于12 000 r/min條件下冷凍離心5 min，棄去上清液后，加入1 mLV(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1混合物，并于12 000 r/min條件下冷凍離心5 min，棄去上清液，并重復(fù)3次。往最終得到的沉淀中加入2 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液(溶于pH為6.5的20 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液)，混勻后于12 000 r/min條件下離心2 min，棄去雜質(zhì)。加入HCl的樣品于280 nm處測(cè)定其吸光值，結(jié)果用于蛋白濃度的測(cè)定；加入二硝基苯腙(dinitrophenylhy drazone, DNPH)的樣品于370 nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果用于羰基值的測(cè)定。用牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以1 mg蛋白質(zhì)中所含的羰基量(mmol)來(lái)表示。

(2)POV值測(cè)定[20]：沿樣品切面中切除20 g左右的肉，剔除肌筋及可見(jiàn)脂肪，絞碎混勻后，再精確稱取5.000 g置于250 mL的碘量瓶中，加入V(氯仿)∶V(冰乙酸)=2∶1混合液25 mL，加塞搖動(dòng)，使其充分溶解，然后精確加入0.5 mL飽和KI溶液，置于15～25 ℃的暗處，避光靜置5 min后，取出加入75 mL蒸餾水，搖勻后馬上用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，臨近終點(diǎn)時(shí),加入0.5 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并強(qiáng)烈振搖直到藍(lán)色消失。過(guò)氧化值計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：V1，樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2，空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c，硫代硫酸鈉溶液的標(biāo)定濃度，mol/L；m，樣品的質(zhì)量，g。

(3)TBARS值測(cè)定[21]：稱取5.000 g樣品于80 mL離心管中，分別加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% TCA、20 mL雙蒸水，在冰浴中以3 000 r/min高速均質(zhì)60 s，然后在2 000 g、4 ℃下離心10 min，上清液過(guò)濾，濾液用雙蒸餾水定容到50 mL。取2 mL濾液，加入2 mL 0.02 mol/L TBA溶液在沸水浴中反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，測(cè)定其532 nm處吸光度值。空白樣的制備：25 mL 20% TCA用雙蒸水定容到50 mL，然后取2 mL濾液加2 mL TBA。TBARS值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算，結(jié)果表示為mg丙二醛(MDA)/kg肌肉。

(4)微生物測(cè)定：無(wú)菌條件下稱取樣品20 g，用無(wú)菌剪刀剪碎，置于180 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，即為質(zhì)量濃度0.1 g/mL稀釋液。按照遞度制取10 倍系列遞增稀釋液。選擇3個(gè)合適的稀釋度，吸取0.1 mL稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，3個(gè)平行，然后將涼至50℃左右的不同培養(yǎng)基注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，適當(dāng)搖勻，待凝固后，于適當(dāng)?shù)臈l件下倒置培養(yǎng)1～2 d。同一稀釋度的3個(gè)培養(yǎng)皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克樣品中所含微生物的數(shù)目。具體的培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions

(5)色差(L*、a*、b*)測(cè)定[22]：采用標(biāo)準(zhǔn)版對(duì)設(shè)備進(jìn)行校正(Y=94.0，x=0.315 6，y=0.332 1)，然后通過(guò)D65光源，8 mm直徑測(cè)量范圍和2°視角測(cè)定產(chǎn)品表面的顏色。其中亮度用L*表示，紅度用a*表示，黃度用b*表示。

(6)質(zhì)構(gòu)測(cè)定[23]：

用圓柱形取樣器和雙面刀將肉餅切成高1 cm，直徑2.5 cm的圓柱體樣品，在室溫下用物性質(zhì)構(gòu)儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定參數(shù)為：探頭型號(hào)P/50，測(cè)前及測(cè)中速度均為2 mm/s，測(cè)后速度為5 mm/s，壓縮比例為50%，觸發(fā)力5 g，測(cè)試間隔時(shí)間為5 s。測(cè)試結(jié)果采用TPA-macro進(jìn)行分析[24]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用SAS 9.2進(jìn)行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果提取物對(duì)捆蹄抗氧化作用

2.1.1 羰基值變化

從表2可以看出，捆蹄在腌制及貯藏過(guò)程中羰基含量顯著增加(P<0.05)，并且橄欖果提取物能顯著降低(P<0.05)捆蹄在腌制及貯藏過(guò)程中的羰基值；在腌制1 d及貯藏過(guò)程中，隨著橄欖果提取物添加量的增加，捆蹄在腌制及貯藏過(guò)程中羰基值顯著(P<0.05)降低，當(dāng)橄欖果提取物添加量達(dá)到200～300 mg/kg時(shí)，不同階段捆蹄中的羰基含量無(wú)顯著差異(P<0.05)。說(shuō)明橄欖果提取物能顯著的抑制捆蹄中脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的氧化，有效提高產(chǎn)品品質(zhì)，并且當(dāng)橄欖果提取物添加量大于200 mg/kg時(shí)有最佳的抑制效果。

表2 橄欖果提取物對(duì)捆蹄羰基值抑制結(jié)果 單位：nmol/g

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 POV值變化

POV值是衡量動(dòng)物油脂脂質(zhì)初級(jí)氧化程度的主要指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定產(chǎn)品中的過(guò)氧化物含量來(lái)表示，是評(píng)價(jià)干腌肉制品脂質(zhì)氧化程度及品質(zhì)的重要指標(biāo)。圖1為不同橄欖果提取物對(duì)捆蹄加工及貯藏過(guò)程中初級(jí)氧化的作用結(jié)果。可以看出，在腌制及貯藏過(guò)程中，捆蹄中的POV值顯著增加，對(duì)照組在貯藏28 d時(shí)POV值達(dá)到1.35 mg/kg；隨著橄欖果提取物添加量的增加，不同階段捆蹄中的初級(jí)氧化產(chǎn)物不斷降低，主要表現(xiàn)為當(dāng)橄欖果提取物添加量大于300 mg/kg時(shí)，與對(duì)照組相比，捆蹄在腌制及貯藏過(guò)程中POV值均有大幅度降低，并且在貯藏28 d后，POV值僅為0.95 mg/kg。因此可以看出，橄欖果提取物能顯著抑制捆蹄中脂質(zhì)的初級(jí)氧化，降低產(chǎn)品中的過(guò)氧化物，從而有效提高產(chǎn)品品質(zhì)。

圖1 橄欖果提取物對(duì)捆蹄POV值抑制效果Fig.1 Inhibition results of olive fruit extract on POV values of bundle hoof

2.1.3 TBARS值變化

TBARS是衡量肉制品中二次氧化的重要指標(biāo)，以肉制品中丙二醛含量表示。從圖2可以看出，隨著橄欖果提取物的增加，捆蹄中TBARS呈顯著的(P<0.05)降低趨勢(shì)，腌制1d后，橄欖果提取物添加量在100～300 mg/kg時(shí)，不同階段捆蹄中的TBARS均顯著(P<0.05)低于對(duì)照組；并且當(dāng)橄欖果提取物添加量為300 mg/kg時(shí)，捆蹄在加工及貯藏過(guò)程中TBARS值均低于0.5 mg/kg，與對(duì)照組相比，具有良好的質(zhì)量安全品質(zhì)。

圖2 橄欖果提取物對(duì)捆蹄TBARS抑制效果Fig.2 Inhibition results of olive fruit extract on TBARS values of bundle hoof

通過(guò)橄欖果提取物對(duì)捆蹄腌制及貯藏過(guò)程中羰基含量、POV值、TBARS值的作用結(jié)果可以看出，橄欖果提取物對(duì)捆蹄中的蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)氧化均有顯著的抑制作用，并且隨著添加量的增加，該抑制作用不斷增加，并且當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)有最佳的抑制作用。

2.2 橄欖果提取物對(duì)捆蹄抑菌作用研究

2.2.1 菌落總數(shù)變化

目前，大部分研究報(bào)道均認(rèn)為橄欖果提取物對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿假單胞菌等革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌都具有顯著抑制作用[10,14-15]。從圖3可以看出，不同處理組捆蹄在貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)均呈顯著的(P<0.05)增加趨勢(shì)，在貯藏28 d時(shí)達(dá)到6.14(lg CFU/g)，發(fā)生腐敗變質(zhì)。但是，隨著橄欖果提取物添加量的增加，捆蹄中的菌落總數(shù)不斷降低，當(dāng)添加量為300 mg/kg有最佳的效果，并且在該添加條件下，產(chǎn)品在貯藏28 d時(shí)菌落總數(shù)僅為4.52(lg CFU/g)，顯著低于對(duì)照組。因此可以看出，橄欖果提取物對(duì)捆蹄加工及貯藏有良好的抑菌作用。

圖3 橄欖果提取物對(duì)捆蹄菌落總數(shù)抑制結(jié)果Fig.3 Inhibition results of olive fruit extract on the total number colonies of bundle hoof

2.2.2 乳桿菌、腸桿菌變化

表3為不同橄欖果提取物對(duì)捆蹄中乳酸菌、腸桿菌的抑制作用結(jié)果。

表3 橄欖果提取物對(duì)捆蹄微生物抑制結(jié)果Table 3 Inhibition results of olive fruit extract on the microorganisms of bundle hoof

注：同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；同列大寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

從表3中可以看出，隨著腌制及貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，捆蹄中的2種微生物呈顯著增加(P<0.05)趨勢(shì)。但是隨著橄欖果提取物添加量的增加，對(duì)2種菌在不同階段均呈現(xiàn)顯著的(P<0.05)抑制作用。橄欖果提取物添加量在100～300 mg/kg，腌制1 d后，乳酸菌數(shù)量隨貯藏期延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，并且隨著橄欖果提取物添加量的增加，該抑制作用不斷增加；當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)，捆蹄在貯藏28 d后乳酸菌僅為4.08(lg CFU/g)，顯著低于對(duì)照組。對(duì)于腸桿菌，橄欖果提取物對(duì)其抑制作用與乳酸菌相似，均表現(xiàn)為隨著橄欖果提取物添加量的增加，該抑制作用不斷增加；當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)，抑制作用最強(qiáng)。

綜合上述分析結(jié)果可以看出，橄欖果提取物對(duì)捆蹄中微生物有明顯的抑制作用，并且隨著橄欖果提取物添加量的增加，其抑制作用不斷增加，當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)，能有效地抑制捆蹄中微生物生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)捆蹄的保鮮期。主要原因是橄欖果提取物中的酚類(單酚類、酚酸類、黃酮類、芪類)、三萜類、花青素等活性成分可以通過(guò)抑制與微生物代謝相關(guān)的酶活性(如脫氫酶)，從而影響微生物的代謝過(guò)程[9,11]。

2.3 橄欖果提取物對(duì)捆蹄色差影響

從表4可以看出，橄欖果提取物對(duì)腌制階段的捆蹄顏色(L*、a*、b*)無(wú)顯著(P>0.05)影響；但是在貯藏28 d后，添加量為200～300 mg/kg處理組捆蹄色差顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，可能與橄欖果提取物中含有的花青素有關(guān)[13]。結(jié)果表明,當(dāng)橄欖果提取物添加量為200～300 mg/kg時(shí)，在捆蹄中具有穩(wěn)定肉色的作用。

表4 橄欖果提取物對(duì)捆蹄色差影響結(jié)果Table 4 Effect of olive fruit extract on the color bundle hoof

2.4 橄欖果提取物對(duì)捆蹄質(zhì)構(gòu)影響

從表5可以看出，雖然不同處理組捆蹄硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性在加工貯藏過(guò)程中不斷變化，但是不同橄欖果提取物對(duì)捆蹄質(zhì)構(gòu)特性無(wú)顯著(P>0.05)影響。

表5 橄欖果提取物對(duì)捆蹄質(zhì)構(gòu)影響結(jié)果Table 5 Effect of olive fruit extract on the texture of bundle hoof

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，橄欖果提取物不僅能有效地抑制捆蹄加工及貯藏過(guò)程中的蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)初級(jí)、二次氧化，而且對(duì)捆蹄中微生物生長(zhǎng)有顯著的(P<0.05)抑制作用。具體表現(xiàn)為，當(dāng)捆蹄中橄欖果提取物添加量在200～300 mg/kg時(shí)，在腌制及貯藏過(guò)程中羰基值、POV值及TBARS結(jié)果顯著(P<0.05)低于對(duì)照組；并且在該添加范圍內(nèi)，捆蹄中的菌落總數(shù)明顯降低，乳酸菌及腸桿菌數(shù)量也顯著(P<0.05)低于對(duì)照組。橄欖果提取物(100～300 mg/kg)對(duì)捆蹄具有護(hù)色的作用，并且對(duì)其質(zhì)構(gòu)特性無(wú)顯著(P>0.05)的影響。因此，橄欖果提取物可延長(zhǎng)捆蹄保質(zhì)期至28 d。