高通量測序結合傳統方法分析4 ℃下鮮切菠菜的菌群變化

郁杰，謝晶

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(農業農村部冷庫及制冷設備質量監督檢驗測試中心(上海)，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海，201306) 4(上海海洋大學 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海，201306)

鮮切凈菜是以新鮮蔬菜為原料，經過分揀、清洗、切分、包裝等一系列處理后制成的即用或即食的蔬菜制品，在行業內也被稱為“最小加工(minimally processed)”產品，具有新鮮、便捷、營養等優點。近年來，我國鮮切蔬菜的消費市場正逐年擴大，但鮮切蔬菜本身含水量較高，又經過切割等程序，導致汁液流失嚴重，這些受傷的組織為微生物提供營養，使多種微生物群落得以繁殖，導致腐敗，這直接限制了產品流通和貨架期。腐敗菌對鮮切蔬菜產生破壞的癥狀主要體現在褐變、產生異味、結構喪失以及在較低程度上的軟腐，這極大地影響到消費者的購買欲望，國外已有學者指出：在鮮切蔬菜的貯藏過程中，腸桿菌、假單胞菌以及乳酸菌等腐敗菌的增長與酸味、褐變、軟腐有強相關性[1-2]。目前對鮮切葉菜微生物的研究主要集中在保鮮技術、清洗方式以及致病菌等領域，對鮮切葉菜中特定腐敗菌的研究較少[3-4]。

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)是一種綠葉蔬菜，人們常常將其鮮切后置于4 ℃下售賣[5]。鮮切菠菜在貯藏過程中易受微生物的侵襲導致腐敗[6]。本研究借助高通量測序技術[7-9]，結合傳統檢測，全面地研究鮮切菠菜在0、4、8 d主要腐敗菌及其演替規律，解析腐敗菌的組成、生理生化特性、豐度及多樣性，以此為指導企業防腐殺菌、產品貯運等工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菠菜的鮮切處理及分組

菠菜：要求大小均一、色澤鮮綠、清潔、無明顯缺陷、無病蟲毒害。大棚種植，于6月份采摘，采摘時間為上午5時，溫度約25 ℃，濕度約70%RH，采后立即配送至實驗室。經去離子水清洗后，將樣品用已滅菌的不銹鋼菜刀距菠菜根部約3 cm處進行鮮切，并在無菌條件下將鮮切菠菜隨機分為3大組，每大組分為3小組，每小組分裝80 g/盒，放入無菌塑料盒，并用透明保鮮袋包好，置于4 ℃下貯藏備用。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 實驗試劑

平板計數瓊脂培養基(PCA)、營養瓊脂培養基(NA)、假單胞菌瓊脂培養基(CFC)、腸桿菌科瓊脂培養基(VRBDA)、葡萄球菌瓊脂培養基(MSA)、梭菌鑒別瓊脂(DRCA)：青島海博生物技術有限公司；微生物生理生化微量鑒定管：青島海博生物技術有限公司；E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit：M5635-02，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：Q10212，Life；2×TaqMaster Mix：P111-03，Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：EC401-03，Transgen。

1.2.2 實驗儀器

高速冷凍離心機(H-2050R-1型)，長沙湘儀離心機有限公司；高溫高壓滅菌鍋(HVE-50)，日本Hi-rayama制造有限公司；PCR儀(T100TM)Thermal Cyeler，BIO-RAD；超凈工作臺(VS-1300L-U)，上?？蹈Ｌ丨h境科技有限公司；恒溫培養搖床(KYC-100C)，上海圣科儀器設備有限公司；電泳儀(DYY-6C、DYCZ-21型)，北京市六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官評定

挑選8名經過培訓的人員進行感官評定，每人每次評定設為3次。標準參照PAILLART等[10]方法，感官評估分為3步進行：①評估葉條的整體顏色及表觀，②對消費者的接受度進行打分，③將葉片平鋪在白色背景下觀察葉片萎焉程度。以上指標評定后分數越高代表品質越好，每項評定滿分為10分，每天評定1次。

1.3.2 腐敗菌的分離純化

(1)在無菌條件下隨機準確稱取樣品10 g，剪碎并混勻，放入90 mL無菌生理鹽水(質量濃度為8.5 g/L) 中，充分搖勻之后用1 mL移液槍加入含有9 mL的生理鹽水試管中進行10倍遞增稀釋，稀釋成所需濃度，選取合適的稀釋濃度，吸取1 mL上述菌懸液，置于表1各個培養基中。

(2)經培養后，從各種培養基中挑取典型生長的、形態不同的菌落，平板劃線法反復分離、純化3次，直至菌落的生長狀態和形態特征表現一致時得到純的菌落，純菌落斜面接種，培養后于4 ℃保存。

(3)每隔1 d進行上述工作，培養條件見表1。

表1 各種微生物菌相的培養條件Table 1 Culture conditions of various microorganisms

1.3.3 菌懸液的制備及保種

用接種環依次挑取經過上述培養基中培養帶有明顯特征的菌落，標號見表1，分別接種至裝有5 mL滅菌營養肉湯培養基的試管內，盡量保證所有數據采集完整，搖床37 ℃、160 r/min振蕩過夜。待菌懸液制備后，用移液槍從每支試管內吸取0.1 mL菌液，垂直滴落在已凝固的營養瓊脂培養基上，均勻涂布，靜置10 min左右，于37 ℃的培養箱內倒置培養24 h，進行保種，待單菌落生成后，置于4 ℃冰箱保藏備用，菌懸液置于冰箱內備用。

1.3.4 菌種的初步鑒定及計數

(1)初步鏡檢：將已獲得純化的菌株進行革蘭氏染色，并用顯微鏡油鏡觀察細胞個體形態、排列等，每一處理均設3次重復，挑選最典型的菌落觀察。

(2)生理生化鑒定：參照崔慧玲等[11]對鮮切菜品的鑒定圖譜，使用相應的微生物生理生化微量鑒定管鑒定后，參考《伯杰細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統鑒定手冊》，各項生理生化試驗每一處理均設3次重復，避免假陽性的發生。

(3)選取菌落總數在30～300 CFU范圍內的平皿，菌落計數參考GB 4789.2—2016[12]中的平板計數法測定，用PCA培養基測定總菌數量。在以上鑒定的基礎上，用選擇性培養基CFC、VRBDA、MSA、DRCA根據已觀察形態及生理生化的結論初步測定假單胞菌、腸桿菌、微球菌、梭菌的菌落數得出在0、4、8 d的大致比例。

1.3.5 總DNA的提取

參照NIEMINEN等[13]的方法在無菌超凈工作臺中，隨機從不同袋子中選取不同部位的菠菜葉片，保證采集樣品的代表性，共稱取10 g菠菜葉片，置于無菌均質袋中，加入90 mL的無菌生理鹽水(質量濃度為8.5 g/L)，劇烈振蕩1 min，取出樣品，靜置10 min后，在10 000 r/min下離心10 min，棄上清，取10 mL沉淀，置于-80 ℃凍存備用。隨后按照OMEGA試劑盒的方法操作，提取細菌總DNA，并用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.6 16S rDNA V3-V4區的PCR擴增及Illumina雙末端測序

在肖英平等[14]實驗方法的基礎上稍作改進，以上述提取的總細菌基因組DNA為模板，引物針對16S rRNA基因V3～V4區合成特異引物，利用341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC引物進行PCR擴增。擴增后的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1的等量混合后測序，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol，將檢測后合格的樣品委托上海生工生物工程有限公司。

1.3.7 生物信息學分析

參照儲建軍等[15]方法進行數據質控及過濾,包括：去除引物接頭序列、序列拼接、質量剪切、去除非擴增區域序列和嵌合體序列，隨后進行blastn比對，在97%的相似水平下進行歸類,得到分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，以此得出每個OTU分類學信息。隨后以隨機抽到的序列數與香農指數(Shannon)構制稀釋度曲線曲線，評估樣品測序數據量的合理性。再者，基于得到的OTUs計算香農指數(Shannon)、菌種豐富度指數(Chao1)、辛普森指數(Simpson)、覆蓋率(Coverage)和ACE等常用的Alpha生物多樣性指數，衡量樣本中物種的多樣性[16]，并且通過貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，在科、屬水平上進行群落豐度統計分析并作圖，得到微生物群落結構組成，鑒定優勢腐敗菌。

2 結果與分析

2.1 感官評定及總菌

圖1及圖2分別顯示了4 ℃下貯藏的鮮切菠菜感官評分、總菌及表觀變化。由圖可知，隨著貯藏時間的增加，鮮切菠菜的感官評價呈下降趨勢，在第8天，其感官評分降至5分以下，變得不可接受，葉片出現大面積萎蔫、發黃并出現不同程度的軟腐，鮮切

部位出現褐變，打開包裝可明顯感受到腐臭味；而總菌含量隨著貯藏時間的增長而增長，在第8天時，超過6 lg CFU/g，兩者指標具有相關性，在第8天，感官和總菌含量皆超出標準，說明已失去商品價值[17]。

圖1 4 ℃下冷藏對鮮切菠菜感官品質和菌落總數的影響Fig.1 Effects of cold storage at 4 ℃ on sensory quality and colony count of fresh cut spinach

圖2 4 ℃冷藏條件下不同貯藏時期鮮切菠菜的品質Fig.2 Quality of fresh cut spinach at different storage periods under 4 ℃ refrigeration

2.2 腐敗菌的初步鑒定

2.2.1 形態學觀察及生理生化實驗

共挑取特征菌落29個，經革蘭氏染色實驗，其中18株為革蘭氏陰性菌，11株為革蘭氏陽性菌，各菌株的鏡檢及生理生化實驗結果見表2。

表2 各個菌株的鏡檢及生理生化實驗結果Table 2 Microscopic examination and physiological and biochemical results of various strains

續表2

菌種編號P2-0、P3-2、P2-4、D1-0、D1-4、P1-8、D2-8P2-2、P2-6、V1-0、V2-4、V1-8、V3-8P1-0、P2-8、V3-4、V2-8P1-0、P3-0、P2-4、P1-8、C1-0、C2-2、C1-4、C2-8P1-0、P2-4、M1-0、M2-0菌落干濕度濕潤濕潤濕潤濕潤濕潤H2O2酶實驗-++++氧化酶實驗+--++明膠水解+-+++吲哚實驗NT+-NTNT葡萄糖利用+++++V-P實驗---++O-F實驗OFFOF初步結論梭菌腸桿菌腸桿菌假單胞菌葡萄球菌

2.2.2 腐敗菌的計數

根據對29株菌株的鏡檢以及生理生化的鑒定結果，分別對0、4、8 d的樣品在不同培養基中的典型菌落進行計數并計算大致比例。由表3可知，在貨架期終點假單胞菌占比達到77.89%，為主要優勢腐敗菌；腸桿菌在貯藏過程中比例下降至21.99%；微球菌、梭菌占比較少，分別為0.55%、0.51%。

表3 4 ℃條件下鮮切菠菜的菌群變化 單位:CFU/g

2.3 高通量測序鑒定

2.3.1 數據質控及稀釋度曲線

由表4可知，3個樣品經過測序后分別得到48 353、62 689、53 046條原始序列，經過質量控制、去除非特異性擴增序列和嵌合體得到44 183、50 954、46 064條有效序列，各個樣品的有效序列分別達到91.4%、81.3%、86.8%，片段長度約428 bp，均達到生物信息分析的要求[18]。

表4 測序數據統計結果Table 4 The statistics results of sequence data

構建稀釋曲線可以反映樣本的測序數據量是否合理，本實驗中，橫坐標代表隨機抽取的序列數量，縱坐標代表的是反映物種多樣性的Shannon指數，當曲線趨于平坦時，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息。圖3代表的是不同貯藏時期的3個樣品：當測序數目分別達到44 183、50 954、46 064時，Shannon指數達到2.19、2.95、2.57，此時繼續增加測序數據量僅產生少量新的OTU，同時稀釋度曲線趨于平坦，這表明測序已趨于飽和，具有代表性。

圖3 各個樣品稀釋性曲線Fig.3 Rarefaction curve of each samples

2.3.2 Alpha多樣性分析

在4 ℃條件下，鮮切菠菜貯藏過程中的Alpha多樣性指數變化如表5所示。首先，各個樣品的Coverage指數均≥0.95，說明本實驗的測序數量充分代表樣品的真實情況[19]；從Chao1、ACE指數來看，貯藏4 d菠菜表面的菌群豐度最高，其次是0 d，最低的是8 d；從Shannon、Simpson指數來看：貯藏4 d菠菜表面的菌群多樣性也明顯高于0 d及8 d，以上說明：貯存4 d的菠菜樣品表面的微生物群落結構最為復雜，這可能是由于在貯存初期(0～4 d)菠菜經過鮮切處理后，導致組織液外滲，為微生物提供了較好的繁殖環境，導致豐度和多樣性上升，在貯存后期(4～8 d)優勢腐敗菌憑借其競爭優勢，消耗營養底物，使得環境改變，導致菌群多樣性降低。

表5 Alpha多樣性指數Table 5 Alpha diversity index

2.3.3 細菌群落分析

使用RDP classifier以及Blast分析對已得的OTU進行物種分類，共鑒定到10門，15綱，23目，52科，89屬。本文在科、屬的分類水平上進行分析。

2.3.3.1 基于科分類水平上的分析

經過鑒定，在科的分類標準下，不同貯藏時間的鮮切菠菜表面菌群的豐度情況如圖4所示。

圖4 基于科分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.4 Bacterial distribution based on the family taxonomical level

由圖4得出，假單胞菌科和腸桿菌科是在整個貯藏期間的主要菌群結構，兩者占比90%以上，為優勢腐敗菌；而其他分類的菌群豐度較低，都小于2%，這表明菌群的多樣性程度較高，而豐度較為集中。從菌群變化的角度來看，隨著貯藏時間的推移，假單胞菌科的豐度呈遞增趨勢，從初始豐度的48.99%到貯藏末期的70.27%；而腸桿菌科則從初始豐度的48.62%不斷遞減至21.75%，其余菌群的微生物均保持在較低豐度，出現上述現象可能是以下原因導致的：(1)在樣品清洗后，假單胞菌科及腸桿菌科的微生物在菠菜葉片表面的黏附強于其他細菌，從而使二者的初始豐度較高[20]；(2)鮮切菠菜在4 ℃低溫下貯藏會明顯抑制腸桿菌的生長[21]，而假單胞菌對低溫具有一定的耐受力[22]，因此，假單胞菌生長速度快于腸桿菌，導致腸桿菌的豐度不斷下降，另一方面，二者的增殖會相對抑制其他科微生物的增長。

2.3.3.2 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖

經過鑒定，在不同貯藏時期，鮮切菠菜表面的微生物在屬的分類水平下共得到89個屬，圖5為在屬的分類水平下豐度占比前十的菌群分布情況。在科水平下為優勢腐敗菌的假單胞菌科，在屬的分類下包括：假單胞菌屬(Pseudomonas)、氮單孢菌屬(Azomonas)，對于腸桿菌科，在屬的分類下主要包括：泛菌屬(Pantoea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、布丘氏菌屬(Buttiauxella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)，除了上述幾種外，豐度靠前的還有氮單孢菌屬(Azomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)等。

圖5 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.5 Bacterial distribution based on the genus taxonomical level

由圖5可知，假單胞菌屬、泛菌屬是鮮切菠菜的初始優勢菌屬，豐度分別達到47.84%、30.7%，而歐文氏菌屬、布丘氏菌屬為次優勢菌屬，豐度為8.09%和4.64%；到了貯存中期，假單胞菌屬的豐度上升至58.25%，泛菌屬豐度下降至13.94%，歐文氏菌屬豐度基本保持不變為8.69%、布丘氏菌屬豐度小幅上升至9.73%；貯存末期，假單胞菌屬占絕對優勢，豐度占比68.97%，而泛菌屬豐度僅占5.4%，歐文氏菌屬占比10.7%，布丘氏菌屬占比4%。

已有文獻證實，假單胞菌屬是許多果蔬植物的腐敗菌，由于其營養方式多樣性及其生理特性，較為適應鮮切菠菜表面的生長環境[23]，其豐度約占腐敗菌的50%～90%[24]，這和本研究結果一致，在該屬中，熒光假單胞菌(P.fluorescens)是引起鮮切菠菜軟腐變質的主要細菌[25]，具有很強的產氨致腐能力，并且可通過PL編碼基因表達產生果膠酸裂解酶(Polygalacturonatelyase，PL)，PL的合成不受碳源種類的影響，并且會破壞菠菜葉片組織引起軟腐[26]。其次，P.fluorescens表面的鞭毛蛋白對更好地定植于鮮切菠菜表面起到了重要作用[27]，以上特點可能是其在整個貯藏期豐度變化的原因，而泛菌屬、歐文氏菌屬在低于10 ℃下生長緩慢，在加上營養底物被假單胞菌屬消耗，間接地抑制其生長。軟腐歐文氏菌屬除了分泌少量PL外，還會分泌果膠甲基半乳糖醛酸酶(Pectin methyl-galacturonase，PML)，有實驗證明：PML在軟化菠菜組織的作用不明顯，但是PME和PL的協同作用下可完全降解菠菜細胞壁上的果膠，從而發生軟腐敗[28]。

3 結論

本實驗借助高通量檢測技術結合傳統生理生化檢測技術探究在4 ℃貯藏條件下，鮮切菠菜不同貯藏時期的菌群變化，結論如下：

鮮切菠菜在不同貯藏時期其微生物的多樣性以及豐度存在較大差異，共鑒定到10門，15綱，23目，52科，89屬，其中假單胞菌科和腸桿菌科為優勢菌科。

在屬水平上，假單胞菌屬(47.84%)、泛菌屬(30.7%)、歐文氏菌屬(8.09%)、布丘氏菌屬(4.64%)是鮮切菠菜的主要初始菌群結構，到了貯存中后期，假單胞菌屬豐度不斷上升至68.97%，成為導致鮮切菠菜腐敗的主要菌屬，泛菌屬、歐文氏菌屬、布丘氏菌屬成為次要腐敗菌。

本實驗2種方法可進行對比，進一步驗證了高通量檢測技術的優勢，精確地定量了菌群組成比例。