屎腸球菌Ef2的安全性評估及其產生物胺氧化酶培養(yǎng)和誘導條件的優(yōu)化

李彬彬,宋桂森,全鑫杰,蒲艷,徐曄,牛淑慧,敖曉琳,陳淑娟,何利,劉書亮,楊勇

(四川農業(yè)大學 食品學院,四川 雅安,625014)

生物胺(biogenic amine, BA)是一類具有潛在毒性的生物活性物質，食品中BA主要是在微生物氨基酸脫羧酶的作用下將游離的氨基酸脫羧而生成的，因此BA廣泛存在于蛋白質豐富的發(fā)酵食品中。適量的BA是人體的活性物質[1]，但攝入過量的外源BA則會危害人體健康[2-7]。面對發(fā)酵食品生產加工過程中高BA含量的問題，除采取控制前體物水平[8]、抑制產胺微生物生長[9]等措施外，常通過接種不具有氨基酸脫羧酶活性而具有生物胺氧化酶活性的微生物來降低發(fā)酵食品中BA含量，并取得了良好的效果[10-12]。

生物胺氧化酶(amine oxidase, AOs) 是廣泛存在于動植物、微生物體內的能夠將已生成的BA分解成相應的醛、氨氣和過氧化氫的一類酶[13-14]。AOs作為BA代謝中的關鍵酶，一直是國內外BA降解研究的熱點。AOs主要分為單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)、二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)。MAO多屬于含銅氧化酶，主要氧化酪胺等；DAO主要作用于組胺和腐胺，屬于含銅的氧化酶；PAO是指所有能氧化多胺類物質的酶，是催化多胺氧化降解的關鍵性酶[15-17]。在微生物體內，該酶可通過誘導產生，常見的誘導方式主要是在培養(yǎng)基中添加BA或以BA為主要氮源，通過對誘導培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化可提升微生物產AOs的能力。周小虎等[18]研究發(fā)現，當以正己胺為誘導氮源時，黑曲霉FF05產AOs酶活力最高，通過對誘導培養(yǎng)條件的優(yōu)化，酶活力顯著提高。

本研究室前期從四川香腸中篩選出了1株不具有氨基酸脫羧酶活性但具有AOs活性的微生物，經鑒定為屎腸球菌Ef2，研究發(fā)現，該菌株對發(fā)酵香腸中色胺、尸胺和組胺、腐胺均有高效的降解能力[19]。為了更好的利用該菌株，并保證發(fā)酵肉制品的安全性，本研究首先對該菌株的安全性進行檢測，并在此基礎上優(yōu)化該菌株產AOs的培養(yǎng)條件和誘導條件，為分離和純化該菌株產生的AOs提供了保證，也為深入研究該菌株產生的AOs奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

屎腸球菌Ef2 (Enterococcusfaecium)，由四川農業(yè)大學肉品科學與技術實驗室保藏。

金黃色葡萄球菌ATCC 25923 (Staphylococcusaureus)，由四川農業(yè)大學動物微生物實驗室保藏。

1.2 試劑與設備

辣根過氧化物酶(250 U/mg)、4-氨基安替比林、2.4.6-3溴-3-羥基苯甲酸等，成都康迪生物科技有限公司；細菌總DNA提取試劑盒、PCR相關試劑，天根公司；蒸餾水、超純水為實驗室自制。

SW-GJ-1FD超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；PCR和凝膠成像儀，Bio-Rad； Varioskan flash全波長酶標儀，美國Thermo Fisher Science公司； pH S-3C+酸度計，上海儀電科學儀器公司；SCIENTZ-950E超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技公司；LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海榮豐有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制作

種子培養(yǎng)基: MRS液體培養(yǎng)基。

誘導產酶培養(yǎng)基:乳糖 50 g，腐胺 6 g，酵母膏 8 g，MgSO43 g，MnSO40.03 g，K2HPO42 g，乙酸鈉 1.5 g，吐溫-80 1 mL，超純水 1 L，調節(jié)pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 屎腸球菌Ef2的安全性評估

1.3.2.1 溶血實驗

以金黃色葡萄球菌為陽性對照，用接種環(huán)蘸取活化的菌液，于血平板劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落長出后有無溶血現象。溶血與否按以下進行判斷[20]：α-溶血，在菌落周圍由于紅細胞的不完全破裂形成草綠色溶血環(huán)；β-溶血，由于紅細胞的完全破裂在菌落形成透明溶血環(huán)；γ-溶血，紅細胞無損壞，菌落周圍無變化未形成透明溶血環(huán)。選取具有γ-溶血特性的菌株，進行后續(xù)實驗。

1.3.2.2 藥敏實驗

采用藥敏片瓊脂擴散法[21]進行藥敏試驗。所用的藥敏紙片：慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、替考拉寧、四環(huán)素、青霉素、紅霉素、利福平、萬古霉素、氨芐西林。

1.3.2.3 耐藥基因的PCR檢測

采用PCR法檢測屎腸球菌Ef2中11種抗生素耐藥相關基因[22-23]，分別為TEM、aac(6′)/aph2、aph(3′)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、TetM、VanA、VanB、mef、ant(2″)-Ⅰ和ant(4′,4″)基因。PCR反應程序為：預變性93 ℃、2 min，變性93 ℃、30 s，復性55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，35個循環(huán)，補充延伸72 ℃、5 min(其中ermB基因按預變性93 ℃、2 min，變性93 ℃、30 s，復性37 ℃、90 s，延伸72 ℃、2 min，35個循環(huán)，補充延伸72 ℃、5 min的條件進行)。將PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2.4 毒力基因PCR檢測

擇取7種常見的和公認的腸球菌毒力基因，分別為gelE、efaA、ace、asaI、cylA、esp和hyl基因，進行PCR擴增[24]。PCR反應條件為:預變性94 ℃ 4 min，變性90 ℃ 40 s，復性58 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，35個循環(huán)，補充延伸72 ℃、5 min。PCR反應采用25 μL反應體系: DNA模板1 μL，premix Taq 10 μL，上/下游引物各 1 μL，ddH2O 12 μL。將PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 誘導產酶培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.3.1 不同氮源及其質量濃度對產酶的影響

在誘導產酶培養(yǎng)基中，分別以質量濃度4 g/L的組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺代替培養(yǎng)基中的氮源，與誘導產酶培養(yǎng)基中其他成分混合，接種培養(yǎng)；在確定最佳誘導氮源的培養(yǎng)基中，分別加入0.5、1、2、4、6、8、10 g/L的誘導氮源，接種培養(yǎng)。3個重復，測定AOs活性，以確定不同氮源及其質量濃度對產酶的影響。

1.3.3.2 不同碳源及其質量濃度對產酶的影響

分別以質量濃度20 g/L的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、麥芽糊精、可溶性淀粉作為碳源，與誘導產酶培養(yǎng)基中除碳源以外的成分混合，接種培養(yǎng)；在確定最佳碳源的培養(yǎng)基中，分別加入10、30、50、70、90、100 g/L的碳源，接種培養(yǎng)。3個重復，測定AOs活性，以確定不同碳源及其質量濃度對產酶的影響。

1.3.3.3 酵母膏及其質量濃度對產酶的影響

在確定最佳碳源、氮源的培養(yǎng)基中，分別加入質量濃度0、1、3、5、7、10、15 g/L的酵母膏，接種培養(yǎng)。3個重復，測定AOs活性，以確定酵母膏對產酶的影響。

1.3.3.4 不同金屬離子及其質量濃度對產酶的影響

在確定最佳碳源、氮源的培養(yǎng)基中，分別加入乙酸鈉(1、3、5、7、9 g/L)、MgSO4(0.5、1、2、3、4 g/L)、MnSO4(0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/L)、CuSO4(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L)、K2HPO4(1、2、3、4、5 g/L)，接種培養(yǎng)，篩選出對酶活影響較大的幾種無機鹽，采用L9(33)正交實驗設計，進行正交實驗。每個處理3個重復，測定AOs活性，以確定不同金屬離子對產酶的影響。

1.3.3.5 誘導產酶培養(yǎng)基成分優(yōu)化的正交實驗

采用L9(33)正交實驗設計，對單因素實驗確定的碳源、氮源以及酵母膏質量濃度進行正交實驗優(yōu)化。

1.3.4 誘導產酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 不同初始pH值對產酶的影響

在最佳誘導產酶培養(yǎng)基中，分別選擇初始pH值為5.0～8.0，以每增加0.5為1個處理。在37 ℃、靜置培養(yǎng)48 h，每個處理3個重復，測定AOs活性，以確定最佳的初始pH值。

1.3.4.2 不同培養(yǎng)溫度對產酶的影響

在最佳誘導產酶培養(yǎng)基中，最優(yōu)初始pH值條件下，分別在25、28、30、34、37、40 ℃靜置培養(yǎng)48 h，每個處理3個重復，測定AOs活性，以確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.3.4.3 不同接種量對產酶的影響

在最佳誘導培養(yǎng)基中，最優(yōu)初始pH值、培養(yǎng)溫度條件下，分別接種為1%、3%、5%、7%、9%的種子液，靜置培養(yǎng)48 h，每個處理3個重復，測定AOs活性，以確定最佳接種量。

1.3.4.4 培養(yǎng)時間對產酶的影響

在最佳誘導培養(yǎng)基中，在最優(yōu)初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量條件下，分別靜置培養(yǎng)12～72 h，以每增加12 h為1個處理，每個處理3個重復，測定AOs活性，以確定菌株的最佳產酶時間。

1.3.4.5 誘導產酶培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗

采用L9(33)正交實驗設計，對上述誘導產酶培養(yǎng)條件進行正交優(yōu)化。

1.3.5 AOs粗酶液的提取

將菌株誘導產酶的培養(yǎng)液在4 ℃ 8 000 r/min離心15 min后，獲得菌體，用預冷的50 mmol/L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液沖洗細胞2次后，懸浮于10倍體積的緩沖液中。加入終濃度為20 mg/mL的溶菌酶，37 ℃處理2 h后，于冰浴下超聲波破碎細胞(功率60%、超聲時間30 min、工作時間6 s)，鏡檢細胞破碎情況。4 ℃ 8 000 r/min離心15 min去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。

1.3.6 酶活性的測定方法

參考FOSTER的方法[25]，以將體系中AOs替換為胺氧化酶商品酶為陽性對照。以將體系中AOs替換為磷酸鉀緩沖液為陰性對照。

酶活單位定義：以每分鐘內510 nm吸光值變化0.01為1個酶活力單位(U)。相對酶活力以每組實驗中酶活力最高為100%。

1.3.7 數據處理與統(tǒng)計分析

2 結果與討論

2.1 屎腸球菌Ef2安全性檢測結果

2.1.1 溶血實驗結果

屎腸球菌Ef2的溶血實驗結果如圖1所示。觀察血平板可知,接種金黃色葡萄球菌菌落周圍形成透明溶血環(huán)，呈β-溶血。接種屎腸球菌Ef2區(qū)域無變化，為γ-溶血，即對溶血無作用或不溶血[20]，因此可證明屎腸球菌Ef2非溶血菌株。

1-金黃色葡萄球菌; 2-屎腸球菌Ef2圖1 溶血實驗及其結果Fig.1 The results of hemolysis test

2.1.2 藥敏實驗結果

由表1可知：屎腸球菌Ef2對四環(huán)素、青霉素、紅霉素、利福平、萬古霉素、氨芐西林等大部分抗生素藥物高度敏感，對替考拉寧中度敏感，對慶大霉素、鏈霉素和氯霉素不敏感。因此可認為屎腸球菌Ef2對絕大多數抗生素敏感，具有一定的安全性。

表1 藥敏試驗結果Table 1 The results of antibiotics susceptibility test

注：抑菌圈直徑≥15高度敏感(H); 10～14中度敏感(I); <10不敏感(L)。

2.1.3 耐藥基因的PCR檢測結果

如圖2所示，2號泳道165 bp左右出現了ant(4′,4″)基因的目的條帶，其余耐藥基因均無被檢出。ant(4′,4″)基因為氨基糖苷類抗生素耐藥相關基因，主要介導對慶大霉素、鏈霉素等氨基糖苷類藥物的敏感程度[23]。該結果與藥敏實驗得到的結果基本一致，可以得出屎腸球菌Ef2對慶大霉素和鏈霉素不敏感，對四環(huán)素、青霉素和萬古霉素等大多數抗生素敏感。

M-DNA marker; 1-VanA; 2-ant(4′,4″); 3-ermb; 4-TEM; 5-TetM; 6-VanB;7-ant(6)-I; 8-ant(2″)-I; 9-aac(6′)/aph(2″); 10-mef; 11-aph(3′)-III圖2 屎腸球菌Ef2耐藥基因的PCR電泳圖Fig.2 The electrophoresis results of drug resistance genesPCR in Enterococcus faecium Ef2

2.1.4 毒力基因的PCR測定結果

毒力基因PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，均無目的條帶檢出，表明屎腸球菌Ef2無毒力基因檢出，可以判定該菌株不會產生常見的毒蛋白。毒力基因的檢測已成為分析腸球菌安全性的重要標準之一[26]，王曉蕊等[27]對豆醬中產細菌素的屎腸球菌進行PCR擴增，發(fā)現無毒力基因檢出，初步證實該菌株是安全的。

M-DNA marker; 1-ace; 2-asaI; 3-cylA; 4-efaA; 5-esp; 6-hyl; 7-gelE圖3 屎腸球菌Ef2毒力基因的PCR電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of virulence genes PCRin Enterococcus faecium Ef2

由于溶血性細菌易引起溶血現象，從而導致敗血癥的發(fā)生[21]。實驗結果證實屎腸球菌Ef2不會引起溶血現象，對紅細胞無影響。通過藥敏實驗和耐藥基因PCR檢測得出屎腸球菌Ef2對慶大霉素、鏈霉素不敏感，而對萬古霉素等其他大部分抗生素抗菌藥物敏感。毒力基因PCR結果無毒力基因檢出，可判定該菌株不會產生相應的毒蛋白。因此結合溶血實驗、藥敏試驗、耐藥基因和毒力基因PCR檢測結果可初步判定屎腸球菌Ef2是安全的，具有潛在的應用前景，可選取該菌株進行后續(xù)研究。

2.2 屎腸球菌Ef2誘導產酶培養(yǎng)基優(yōu)化結果

2.2.1 氮源及其質量濃度對酶活力的影響

不同誘導氮源及其質量濃度對屎腸球菌Ef2產AOs活力的影響結果由圖4所示。由圖可知，腐胺作為誘導培養(yǎng)基的氮源時，酶活力最高，尸胺最低。隨著腐胺質量濃度升高，AOs酶活力也隨之升高，當腐胺質量濃度> 4 g/mL后，酶活力開始逐漸下降，由此可以得出，高濃度誘導氮源能夠抑制酶活力。BA對微生物產AOs有著重要的影響，OKAMURA等[28]研究發(fā)現酪胺等BA能夠特異性誘導Klebsiellaaerogenes產酪胺氧化酶。朱霞[29]分別用丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、芐胺作為黑曲霉產AOs的誘導氮源，發(fā)現正己胺的誘導能力最好，丙胺和芐胺的誘導能力較差，因此選取正己胺作為唯一的誘導氮源。由于菌株的不同，以及BA之間的結構性質差異，影響著微生物對BA的利用。因此在后續(xù)的實驗中選取腐胺為誘導氮源，其質量濃度為4 g/mL。

圖4 不同氮源及其質量濃度對AOs酶活力的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources and mass concentrations on the activity of amine oxidase

2.2.2 碳源及其質量濃度對酶活力的影響

不同誘導碳源及其質量濃度對屎腸球菌Ef2產AOs酶活力的影響結果由圖5所示。由圖可知，不同碳源對AOs的誘導結果差異較大，說明碳源對屎腸球菌Ef2產AOs酶的影響較大，其中乳糖對產AOs的效果最好，蔗糖對產AOs的效果最差，低于40%。因此選擇乳糖為誘導產酶培養(yǎng)基的碳源。隨著乳糖質量濃度的升高，AOs酶活力呈先上升后下降趨勢。當乳糖質量濃度為50 g/L時，酶活力最高。因此在后續(xù)實驗中選擇乳糖質量濃度為50 g/L。但在黑曲霉的相關研究中，發(fā)現碳源對菌株產AOs影響不顯著，不同碳源條件下黑曲霉均能較好的完成生長[18]，這可能是不同菌種之間的差異造成的。

圖5 不同碳源及其質量濃度對AOs酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources and mass concentrations on the activity of amine oxidase

2.2.3 酵母膏及其質量濃度對酶活力的影響

酵母膏及其質量濃度對屎腸球菌Ef2產AOs酶活力的影響結果由圖6所示。當不添加酵母膏，即酵母膏濃度為0時，AOs酶活力最低。隨著酵母膏質量濃度逐漸升高，AOs酶活力也隨之升高，可知酵母膏的添加有利于AOs的產生，可能與酵母膏為菌株的生長提供了必要的生長因子有關[30]。當濃度>10 g/L時，酶活力下降，可得出高濃度的酵母膏能夠抑制AOs酶活力。因此在后續(xù)實驗中選取酵母膏質量濃度為10 g/L。

圖6 酵母膏及其質量濃度對AOs酶活力的影響Fig.6 Effect of yeast extract and mass concentrations on the activity of amine oxidase

2.2.4 不同金屬離子及其質量濃度對酶活力的影響

由不同金屬離子及其質量濃度對屎腸球菌Ef2產AOs酶活力的影響結果表明Mg2+、Na+、Mn2+對屎腸球菌Ef2產生物胺氧化酶的影響較大，且在最適濃度處的酶活力較其他金屬離子高，因此選擇Mg2+、Na+、Mn2+進行后續(xù)的正交實驗。

2.2.5 不同金屬離子對產酶影響的正交實驗結果

在誘導培養(yǎng)基中添加Mg2+、Na+、Mn2+，并對這3個因素的濃度復配進行正交實驗優(yōu)化。實驗方案和結果如表2所示。

表2 不同金屬離子對產酶影響的正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results of effect of differentmetal ions on enzyme production

由表2可知，Mg2+、Mn2+、Na+的極差值分別為1.32、3.06、12.8。Na+的極差值最大，其次為Mn2+。因此Na+和Mn2+在金屬離子中是影響屎腸球菌Ef2產AOs的主要因素，Mg2+影響較小。3個因子的主次順序為C→B→A。由表3方差分析結果可知，Na+在95%的置信度下影響顯著，說明金屬離子中Na+對誘導屎腸球菌Ef2產AOs有顯著性差異，與極差分析結果相一致。而Mg2+和Mn2+對誘導屎腸球菌Ef2產AOs不存在顯著性差異。

表3 正交實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

注：*表示P<0.05。

根據此正交實驗設計得出各因子的最佳水平為A3→B1→C3，即Mg2+、Mn2+、Na+的質量濃度分別為3 g/L、0.03 g/L、1.5 g/L得到的AOs的活力最高。在此條件下進行誘導產酶，得到酶活力為12.54 U/mL。

2.2.6 誘導產酶培養(yǎng)基的正交實驗結果

由表4可知，碳源、氮源、酵母膏的極差值分別為5.95、16.48、7.01。氮源的極差值最大，其次為酵母膏。因此在以乳糖為主要碳源、腐胺為主要氮源的誘導產酶培養(yǎng)基中，氮源和酵母膏是影響屎腸球菌Ef2產AOs的主要因素，碳源影響較小。3個因子的主次順序為B→C→A。由表5方差分析結果可知，氮源在95%的置信度下影響顯著，說明氮源對誘導屎腸球菌Ef2產AOs有顯著性差異，與極差分析結果相一致。而碳源和酵母膏濃度對誘導屎腸球菌Ef2產AOs不存在顯著性差異。

表4 誘導產酶培養(yǎng)基正交實驗結果Table 4 Orthogonal test results of medium for theenzyme induction

表5 正交實驗方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment

注：*表示P<0.05。

根據此正交實驗設計得出各因子的最佳水平為A2→B3→C1，即乳糖、腐胺、酵母膏的質量濃度分別為50、6、8 g/L得到的AOs的活力最高。在此條件下進行誘導產酶，得到酶活力為15.01 U/mL。

2.3 屎腸球菌Ef2誘導產酶培養(yǎng)條件優(yōu)化結果

2.3.1 誘導產酶培養(yǎng)條件的單因素實驗結果

當初始pH值為7.0時酶活力最高，最有利于AOs的產生。培養(yǎng)溫度可能影響著菌株的生長代謝情況，當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，由于菌株的生長代謝旺盛，酶活力達到最高，因此選擇誘導培養(yǎng)溫度為30 ℃。當接種量為1%時，酶活力最高。隨著培養(yǎng)時間的增加酶活力在36 h處達到最高，可能是由于以乳糖為碳源，以腐胺為主要氮源的誘導培養(yǎng)基并不適宜屎腸球菌Ef2的生長，在誘導產酶前期，菌株微生物為了適應培養(yǎng)基環(huán)境，分泌出AOs來維持生長；當培養(yǎng)時間超過36 h時，由于在微生物生長過程中，培養(yǎng)液處于動態(tài)變化之中，再加上菌株不能完全利用腐胺進行生長，隨著營養(yǎng)物質不斷消耗，各種代謝產物隨著細胞的生長不斷分泌出來，積累在培養(yǎng)基中，老化的細胞自溶，從而影響了AOs的產生，導致酶活力下降。

2.3.2 誘導產酶培養(yǎng)條件的正交實驗結果

表6 誘導產酶培養(yǎng)條件正交實驗結果Table 6 Orthogonal test results of culture conditions forthe enzyme induction

由表6可知，pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間的極差值分別為14.70、6.24、13.01、33.64。培養(yǎng)時間的極差值最大，其次分別為pH值、接種量、培養(yǎng)溫度。因此在以乳糖為主要碳源、腐胺為主要氮源的誘導產酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間和pH值是培養(yǎng)條件中影響屎腸球菌Ef2產AOs的主要因素，培養(yǎng)溫度的影響最小，說明培養(yǎng)時間對誘導屎腸球菌Ef2產AOs有著重要的影響。4個因子的主次順序為D→A→C→B。根據此正交實驗設計得出各因子的最佳水平為A2→B3→C1→D3，即pH、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間分別為7.0、32 ℃、0.5%、36 h得到的AOs的活力最高，該結果與周小虎等[18]對黑曲霉產AOs培養(yǎng)條件優(yōu)化的結果一致。在此條件下驗證實驗結果為26.12 U/mL。

經過上述實驗對屎腸球菌Ef2產酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，進行誘導產酶，酶活力提高了139.63%。

3 結論

采用溶血實驗、藥敏實驗、常見的耐藥基因和毒力基因的PCR擴增對屎腸球菌Ef2進行安全性檢測，結果發(fā)現溶血實驗呈陰性、無毒力基因檢出，對慶大霉素、鏈霉素不敏感，而對萬古霉素等其他大部分抗生素抗菌藥物敏感，因此初步判定該菌株是安全的，具有潛在的應用前景，可用作后續(xù)實驗的研究對象。通過單因素結合正交實驗對屎腸球菌Ef2產AOs的誘導培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，最后確定誘導培養(yǎng)基的最佳成分為：乳糖50 g/L、腐胺6 g/L、酵母膏8 g/L、MgSO43g/L、MnSO40.03 g/L、乙酸鈉1.5 g/L，最佳培養(yǎng)條件為：初始pH 7.0、接種量0.5%、培養(yǎng)時間36 h、培養(yǎng)溫度32 ℃。AOs酶活力從誘導前的10.9 U/mL提升至26.12 U/mL，酶活力提高了139.63%。本研究結果表明，屎腸球菌Ef2是安全的，不具有產毒基因，這對接種該菌株于發(fā)酵肉制品中來降低其中BA提升發(fā)酵肉制品的食用安全性具有重要意義，并且通過對培養(yǎng)及誘導條件的優(yōu)化可顯著提升該菌株產AOs的活力，為深入研究AOs提供了理論基礎。