重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)樹莓酮

王程程，鄭璞*，陳鵬程，楊波

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

樹莓酮，又稱為覆盆子酮[1-2]，是樹莓果的主要香氣成分，具有特征性甜果香氣[3-4]，存在于樹莓、黑莓、葡萄和大黃等水果與蔬菜中[5]。覆盆子酮由于其獨(dú)特的香味特性在食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)及農(nóng)業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用[6-8]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)覆盆子酮可以作用于脂肪代謝，具有減肥功效[9-10]。現(xiàn)如今覆盆子酮在香料工業(yè)中，已成為僅次于香蘭素的一種具有極高經(jīng)濟(jì)價值的香料[11]。

水果中覆盆子酮的含量極低，只有1～4 mg/kg[12]，因此從植物中抽提覆盆子酮的成本很高，約為$3 000 /kg[13-14]。目前覆盆子酮的工業(yè)生產(chǎn)主要以化學(xué)合成法為主，但是根據(jù)EC香精指示(88/388/EEC)文件的要求，化學(xué)合成的覆盆子酮并不屬于天然覆盆子酮，這使得其應(yīng)用領(lǐng)域受到一定的限制。近年來通過微生物代謝工程合成覆盆子酮的研究逐漸興起[15]。2007年BEEKWILDER等[5]首次構(gòu)建合成覆盆子酮的重組大腸

桿菌，但其產(chǎn)量僅為5 mg/L，并伴有柚皮素等其他物質(zhì)生成。2016年LEE等[16]在酵母菌中構(gòu)建了覆盆子酮的從頭合成途徑，產(chǎn)量為2.8 mg/L，同時以對香豆酸為前體生產(chǎn)覆盆子酮的最高產(chǎn)量達(dá)到7.5 mg/L。本文以對香豆酸為底物，利用源于植物的4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL1)[16]、芐基丙酮合酶(benzalacetone synthase，BAS)[17]、芐基丙酮還原酶(raspberry ketone/zingerone synthase，RZS1)[18]3個基因，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1，導(dǎo)入大腸桿菌中異源表達(dá)，以提高大腸桿菌工程菌合成覆盆子酮的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒(表1)

表1 本研究中所用質(zhì)粒及菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.2 酶與試劑

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、QuickCutEcoR I、QuickCutHind III、QuickCutSal I、QuickCutKpn I、QuickCutBgl II均購自TaKaRa公司；柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、IPTG、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素：生工生物工程(上海)股份有限公司；引物的合成以及測序由金唯智生物科技有限公司完成；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品底物對香豆酸(純度≥98%)、中間產(chǎn)物對羥基亞芐基丙酮(純度≥97%)、產(chǎn)物覆盆子酮(純度≥99%)：阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：含胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH為7.0。

TB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油5，KH2PO42.31，K2HPO412.54，pH為7.0。

固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉。

相應(yīng)的抗生素(50 mg/L硫酸鏈霉素，100 mg/L氨芐青霉素)。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

小型高速離心機(jī)(Centrifuge 5418)，德國Eppendorf公司；臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL-20M)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；721可見光分光光度計(JH-12-12)，上海菁華科技儀器有限公司；金屬浴(MK-20)，杭州奧盛儀器有限公司；超聲破碎儀(92-IIN)，寧波新芝生物科技股份有限公司；酶標(biāo)儀(EPOCH2T)，美國伯騰儀器有限公司；PCR儀(Biosafer 9700)，賽飛(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的片段的獲得及擴(kuò)增

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將目的基因4CL1的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pCDF-DUET-1用快切酶EcoR I與Hind III進(jìn)行雙酶切，純化并回收；將目的基因BAS的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-DUET-1用快切酶EcoR I與Sal I進(jìn)行雙酶切，純化并回收；將酶切的PCR產(chǎn)物和對應(yīng)的線性質(zhì)粒使用T4連接酶16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物加入到E.coliJM109的感受態(tài)中，42 ℃熱擊90 s，之后將其放冰中靜置2 min，加入1 mL LB培養(yǎng)基，于37 ℃，110 r/min培養(yǎng)1 h之后，離心收集菌體，并將菌體重懸于100 μL的LB培養(yǎng)基中，分別涂布于含有50 mg/L的硫酸鏈霉素及100 mg/L的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證。將驗證正確的重組菌株進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pCDF-4CL1和pET-BAS，并進(jìn)行雙酶切驗證，將菌落PCR與雙酶切驗證都正確的質(zhì)粒送去測序。將目的基因RZS1的PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pET-BAS按照同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-BAS-RZS1。重組質(zhì)粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1，構(gòu)建圖形如圖1所示。

a-質(zhì)粒pCDF-4CL1;b-質(zhì)粒pET-BAS;c-質(zhì)粒pET-BAS-RZS1圖1 重組質(zhì)粒圖譜Fig.1 Maps of recombinant plasmids

將菌落PCR、雙酶切及測序驗證都正確的重組質(zhì)粒pCDF-4CL1和PET-BAS-RZS1同時導(dǎo)入到E.coliW3110 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于添加50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，之后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證，獲得陽性克隆，得到重組大腸桿菌。

1.2.3 培養(yǎng)方法

搖瓶培養(yǎng)方法：將-80 ℃甘油管保藏的重組菌株接種在添加50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素抗性的LB固體平板上分離活化后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、110 r/min過夜培養(yǎng)。以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量將種子液接種于新鮮的40 mL TB培養(yǎng)基(含有50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素)中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)到OD600在0.8～1.2范圍時，加入誘導(dǎo)劑IPTG以誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。每隔12 h取1次樣，用HPLC檢測底物對香豆酸和產(chǎn)物覆盆子酮的含量。所有的搖瓶發(fā)酵設(shè)置3個平行，取平均值。

分批發(fā)酵培養(yǎng)方法：將-80 ℃甘油管保藏的重組菌株接種在添加50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素抗性的LB固體平板上劃線活化后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、110 r/min搖瓶過夜培養(yǎng)。以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于75 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)8 h作為種子液，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于3 L發(fā)酵罐中(裝液量為1.5 L；TB培養(yǎng)基)。發(fā)酵條件如下：攪拌轉(zhuǎn)速隨溶氧變化，溶氧保持在20%～30%，通氣量1 vvm，體積分?jǐn)?shù)25%的氨水和25%的硫酸維持發(fā)酵液的pH為7.0。每隔2～3 h取1次樣，測量OD600、殘?zhí)羌暗孜飳ο愣顾岷彤a(chǎn)物覆盆子酮的含量。

分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)方法：前期種子液的培養(yǎng)方式如分批發(fā)酵培養(yǎng)方法，發(fā)酵罐上培養(yǎng)方法有所變化，其發(fā)酵條件如下：攪拌轉(zhuǎn)速隨溶氧變化，溶氧保持在20%～30%，通氣量 1 vvm，體積分?jǐn)?shù)25%的氨水和25%的硫酸維持發(fā)酵液的pH為7.0。每隔2～3 h取一次樣，測量OD600、殘?zhí)羌暗孜飳ο愣顾岷彤a(chǎn)物覆盆子酮的含量，每當(dāng)葡萄糖消耗完時一次性補(bǔ)加20 g/L左右的葡萄糖。

1.2.4 重組菌株搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

起始誘導(dǎo)時間優(yōu)化：將過夜培養(yǎng)的種子液以5%的接種量接種至40 mL新鮮的TB培養(yǎng)基(含有50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素)中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)1、1.25、1.5、1.75、2、2.25及2.5 h時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG及終質(zhì)量濃度為300 mg/L的底物對香豆酸，在20 ℃、110 r/min條件下誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，培養(yǎng)72 h發(fā)酵結(jié)束，取樣，HPLC檢測產(chǎn)物覆盆子酮的產(chǎn)量。

IPTG濃度優(yōu)化：將過夜培養(yǎng)的種子液以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至40 mL新鮮的TB培養(yǎng)基(50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素)中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)2 h時加入終濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L的IPTG及終質(zhì)量濃度為300 mg/L的底物對香豆酸，在20 ℃、110 r/min條件下誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，培養(yǎng)72 h發(fā)酵結(jié)束，取樣，HPLC檢測產(chǎn)物覆盆子酮的產(chǎn)量。

誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：將過夜培養(yǎng)的種子液以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至40 mL新鮮的TB培養(yǎng)基(50 mg/L硫酸鏈霉素和100 mg/L氨芐青霉素)中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)2 h時加入0.8 mmol/L的IPTG以及終質(zhì)量濃度為300 mg/L的底物對香豆酸，分別放到16、20、25、30及37 ℃條件下誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，培養(yǎng)72 h發(fā)酵結(jié)束，取樣，HPLC檢測產(chǎn)物覆盆子酮的產(chǎn)量。

1.2.5 底物及代謝產(chǎn)物的定量檢測

采用高效液相色譜(HPLC)檢測方法。

紫外檢測方法：取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，之后取500 μL上清液與等體積的甲醇混合，12 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的濾膜過濾，HPLC(Waters)定量檢測底物對香豆酸和產(chǎn)物覆盆子酮。具體檢測條件：色譜柱為AmethystC18-H(4.6 mm×250 mm, 5 μm)反相色譜柱，檢測波長222 nm，柱溫35 ℃，流動相為V(乙腈)∶V(0.1%磷酸)=2∶8，進(jìn)樣量為20 μL，流速1 mL/min。

示差檢測方法：取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的濾膜過濾，HPLC(Waters)定量檢測代謝產(chǎn)物乙酸。具體檢測條件：色譜柱為Carbomix H-NP 10∶8%(7.8 mm×300 mm, 10 μm)反相色譜柱，柱溫55 ℃，流動相為3.3 mmol/L硫酸，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建

以合成的4CL1，BAS和RZS1基因為模板，采用引物4CL1F、4CL1R, BASF、BASR, RZS1F、RZS1R進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，并用核酸電泳表示其大小。目的基因4CL1大小為1 686 bp，BAS為1 155 bp，RZS1為1047 bp，如圖2所示。圖2-a所示的目的條帶大小約為1 600 bp，與4CL1大小吻合，圖2-b所示的目的條帶大小約為1 100 bp，與BAS大小相吻合，圖2-c所示的目的條帶大小約為1 000 bp，與RZS1大小吻合。

a-4CL1基因；b-BAS基因；c-RZS1基因圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳Fig.2 Electrophoretograms of PCR products

將重組質(zhì)粒pCDF-4CL1和質(zhì)粒pET-BAS-RZS1分別導(dǎo)入到E.coliJM109的感受態(tài)中，進(jìn)行菌落PCR驗證，挑取陽性克隆，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用EcoR I與Hind III對重組質(zhì)粒pCDF-4CL1進(jìn)行雙酶切驗證，驗證結(jié)果如圖3-a所示，其目標(biāo)條帶在1 000 bp與2 000 bp之間，與已知4CL1大小1 686 bp位置相符合；分別使用EcoR I、Sal I，Bgl II、Kpn I及EcoR I、Kpn I對重組質(zhì)粒pET-BAS-RZS1進(jìn)行酶切驗證，驗證結(jié)果如圖3-b所示。

a-質(zhì)粒pCDF-4CL1雙酶切驗證核酸膠圖；b-質(zhì)粒pET-BAS-RZS1雙酶切驗證膠圖;a-中泳道1中1 500～2 000 bp中間的條帶表示4CL1基因；b中泳道1中1 000 bp左右的條帶表示RZS1基因，泳道2中1 000～1 500 bp中間的條帶表示BAS基因，泳道3中2 000～3 000 bp中間的條帶表示RZS1與BAS的基因長度之和圖3 重組質(zhì)粒酶切驗證Fig.3 Identification of recombinant plasmids by digestion with restriction endonuclease

由圖3-b可知，其1、2泳道的目標(biāo)條帶都在1 000 bp與2 000 bp之間，與已知RZS1、BAS大小位置相符合，3泳道的目的條帶在2 000 bp與3 000 bp之間，與BAS和RZS1相加的大小位置相符；將驗證正確的重組質(zhì)粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1進(jìn)行測序驗證，并將測序正確的質(zhì)粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1同時轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliW3110 (DE3)中，以獲得重組菌株WCC-1。

2.2 重組菌株WCC-1產(chǎn)覆盆子酮培養(yǎng)條件優(yōu)化

首先確定重組菌株WCC-1開始誘導(dǎo)的最佳時間，接種1 h后開始添加誘導(dǎo)劑IPTG，起始誘導(dǎo)時間范圍為1～2.5 h，其中時間間隔為15 min，誘導(dǎo)到72 h后發(fā)酵結(jié)束，取上清液按照1.2.5所述的方法檢測覆盆子酮的含量，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)2 h時添加IPTG，可以獲得最大的覆盆子酮產(chǎn)量，為91.55 mg/L，其結(jié)果如圖4。

圖4 起始誘導(dǎo)時間對覆盆子酮產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of culture age on the production of raspberryketone

在最佳起始誘導(dǎo)時間的基礎(chǔ)上確定誘導(dǎo)劑IPTG的最適濃度，使IPTG濃度變化從0到1.5 mmol/L設(shè)置梯度變化，誘導(dǎo)到72 h后發(fā)酵結(jié)束，取上清液按照1.2.5所述的方法檢測覆盆子酮的含量，如圖5。發(fā)現(xiàn)隨IPTG濃度的增加，覆盆子酮的產(chǎn)量增加。當(dāng)IPTG濃度為0.8 mmol/L時，覆盆子酮的產(chǎn)量達(dá)到最高，為95.59 mg/L，之后再增加誘導(dǎo)劑IPTG的用量對覆盆子酮的產(chǎn)量并無明顯的提高作用，且考慮到經(jīng)濟(jì)因素最終確定最適IPTG濃度為0.8 mmol/L。

圖5 不同IPTG濃度對覆盆子酮產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of IPTG concentration on the production of raspberry ketone

在一定溫度范圍內(nèi)，過高的溫度會導(dǎo)致蛋白快速表達(dá)，折疊出錯，易形成包涵體，但過低的溫度又會影響菌體的生長，從而影響產(chǎn)物產(chǎn)量，因此誘導(dǎo)溫度在蛋白表達(dá)過程中起關(guān)鍵性的作用。如圖6所示，在最佳起始誘導(dǎo)時間和最適誘導(dǎo)劑IPTG添加量條件下，在16～37 ℃范圍內(nèi)設(shè)置了5個溫度梯度，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時，覆盆子酮的產(chǎn)量最高，達(dá)到了125.86 mg/L，而且可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，覆盆子酮的產(chǎn)量急劇下降，證明誘導(dǎo)溫度確實對產(chǎn)物產(chǎn)量有非常大的影響。

圖6 不同誘導(dǎo)溫度對覆盆子酮產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of induction temperature on the production of raspberry ketone

2.3 重組菌株3 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)覆盆子酮

2.3.1 重組菌株WCC-1分批發(fā)酵

按照1.2.3中所示的分批發(fā)酵培養(yǎng)方法，接種后37 ℃培養(yǎng)至OD600為6～8時，將發(fā)酵溫度降到30 ℃，加入500 mg/L的底物對香豆酸以及0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，發(fā)酵結(jié)果如圖7所示。

圖7 重組菌株WCC-1分批發(fā)酵Fig.7 Batch fermentation of recombinant strain WCC-1

加入誘導(dǎo)劑后覆盆子酮開始積累，接種7 h后葡萄糖耗盡，同時細(xì)胞開始以已經(jīng)積累的乙酸作為碳源，發(fā)酵20 h之后葡萄糖和乙酸全部消耗完，OD600基本保持在22左右，在45 h時覆盆子酮的產(chǎn)量達(dá)到最大，為78.38 mg/L。LIM等[17]研究重組大腸桿菌合成白藜蘆醇時，發(fā)現(xiàn)通過添加淺藍(lán)菌素抑制脂肪的合成，增加胞內(nèi)丙二酰CoA的含量，從而使得白藜蘆醇的產(chǎn)量提高了2倍，說明了前體物質(zhì)丙二酰CoA的重要性。丙二酰CoA也是重組大腸桿菌合成覆盆子酮的前體之一，分批發(fā)酵產(chǎn)量低于搖瓶產(chǎn)量的原因，一方面可能是由于乙酸的產(chǎn)生消耗了部分乙酰CoA，使得合成覆盆子酮的前體物質(zhì)丙二酰CoA的供給不足；另一方面，也有可能是發(fā)酵罐中菌體生長優(yōu)于搖瓶發(fā)酵，葡萄糖供給相對不足，造成覆盆子酮的產(chǎn)量較低。

2.3.2 重組菌株WCC-1補(bǔ)料分批發(fā)酵

種子液制備及罐上培養(yǎng)方法同2.3.1中所述的分批發(fā)酵培養(yǎng)方法，補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果如圖8所示，接種后6 h時葡萄糖耗盡，開始進(jìn)行一次性補(bǔ)料(20 g/L葡萄糖)，此時每當(dāng)葡萄糖耗盡就進(jìn)行補(bǔ)料，一共補(bǔ)料6次，菌體量在51 h時達(dá)到最大，之后開始緩慢下降，說明細(xì)胞生長進(jìn)入衰亡期。在這一階段，葡萄糖和乙酸都已耗盡，覆盆子酮產(chǎn)量增速也趨于平緩，在68 h時，產(chǎn)物覆盆子酮的產(chǎn)量達(dá)到峰值，為178.13 mg/L，較分批發(fā)酵提高2.27倍。

圖8 重組菌株WCC-1補(bǔ)料分批發(fā)酵Fig.8 Fed batch fermentation of recombinant strain WCC-1

3 結(jié)論

通過在大腸桿菌W3110(DE3)中引入來源于植物的4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL1)、芐基丙酮合酶(BAS)和芐基丙酮還原酶(RZS1)基因，成功構(gòu)建了重組菌株WCC-1。通過對起始誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，該菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)覆盆子酮質(zhì)量濃度可達(dá)125.86 mg/L。在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，覆盆子酮質(zhì)量濃度提高到178.13 mg/L，較目前已報道的微生物產(chǎn)覆盆子酮的最高產(chǎn)量(7.5 mg/L)顯著提高，并展現(xiàn)了微生物發(fā)酵生產(chǎn)樹莓酮的應(yīng)用前景。