HIV/AIDS患者外周血程序性死亡受體-1的表達及臨床意義

陳 琛，趙長城2，王 勇，徐前明，劉 亞

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵犯并破壞機體免疫系統引起的疾病，對人類健康造成極大威脅。最近，以調控協同刺激分子信號通路為代表的治療策略，為改善HIV/AIDS患者的免疫功能提供了新的手段和理念。

程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)是與T淋巴細胞功能耗竭和凋亡有關的協同刺激分子，可以細胞膜型和可溶性兩種形式存在。既往對該分子的研究大多采用流式細胞術對膜型蛋白進行測定，但對其可溶性形式(soluble PD-1，sPD-1)的表達水平及臨床意義則鮮有報道。因此，本文擬通過半定量RT-PCR法測定PD-1 mRNA的表達，并使用ELISA方法測定血清中sPD-1蛋白的表達水平，以分析其在HIV 致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1研究對象 收集安徽省立醫院感染病院2017年6月-2017年12月HIV/AIDS病例共61例，包括31例依從性良好的接受抗病毒治療及30例未接受抗病毒治療的患者，均為男性，平均年齡40.81±14.11歲。所有病例確認均符合中華人民共和國HIV/AIDS國家診斷標準，排除梅毒、乙肝、丙肝、結核等系統性感染性疾病。另選健康者35例，均為男性，平均年齡42±6.38歲。本研究經安徽省立醫院傳染病院醫學倫理學委員會批準(No. 20161124002)，并經患者知情同意。

1.1.2主要試劑 淋巴細胞分離液(天津灝洋，LTS1077)；核酸提取試劑盒(廈門泰普，RNA-blood-M)；反轉錄試劑盒(TaKaRa，RR036A)；內參GAPDH引物(上海生工，B661104)；BD MultitestTMCD3/CD8/CD45/CD4(美國BD Pharmingen，340499)；人類免疫缺陷病毒I型核酸定量檢測試劑盒(廈門安普利，R2222)；Human PD-1 ELISA Kit(上海LanpaiBio公司，013655)。

表1 調查對象基本情況

Tab.1 Characteristics of the study population

項目例數(百分比%)年齡治療組(n=31)未治療組(n=30) <20歲4(12.90)2(6.67) 20-55歲20(64.52)20(66.67) >55歲7(22.58)8(26.6)CD4+ (個/mm3) >35010(32.26)8(26.67) <35021(67.74)22(73.33)CD4/CD8 >1.55(16.13)2(6.67) 0.5-1.517(54.84)16(53.33) <0.59(29.03)12(40.00)HIV viral loads(IU/mL) <1.00×103 18(56.07)13(43.33) 1.00×103 -1.00×1059(29.03)11(36.67) >105 4(12.90)6(20.00)

1.2.3主要儀器 TaqMan實時熒光定量RT- PCR 擴增儀(廈門安普利9800型)；全自動核酸提取工作站(廈門安普利Anas 1000)；FACS Calibur流式細胞儀(BD公司，美國)；凝膠成像系統(上海勤翔，CLINX GenoSens1860)。

1.2 實驗方法

1.2.1標本的采集及處理 所有研究對象均為清晨空腹采血，用普通促凝真空采血管和EDTA-K2抗凝真空采血管采靜脈血各2 mL。促凝血室溫靜置30 min，2 000× g離心10 min后取血清，-80 ℃凍存備用；抗凝血標本置4 ℃保存，6 h內送檢。

1.2.2CD4+T淋巴細胞數量的測定 在流式細胞分析管中加入EDTA-K2抗凝血50 μL，按照BD MultitestTM CD3/CD8/CD45/CD4抗體試劑盒說明書，用FACSCalibur流式細胞儀檢測CD4+T淋巴細胞數。

1.2.3PD-1 mRNA水平的測定

1.2.3.1引物設計及合成 針對PD-1 基因序列設計特異性引物，引物序列為：上游: 5-CGGCCAGTTCCAAACCCT-3′，下游: 5′-CCATTCCGCTAGGAAAGACA-3′。交由南京擎科生物科技有限公司進行引物合成。

1.2.3.2人外周血單個核淋巴細胞(PBMCs)的分離 按照人外周血淋巴細胞分離液說明書進行操作。將EDTA-K2抗凝血350 × g離心10 min。將血漿棄去，保留血細胞，稀釋。加入Ficoll淋巴細胞分層液。向分層液上面的淋巴細胞層中加入清洗液10 mL，顛倒混勻。離心，倒掉上清，彈散細胞團后，將PBMC濃度調至2.0×106·mL-1，備用。

1.2.3.3cDNA的合成 按照說明書操作，采用RNA提取試劑盒提取PBMCs中的總RNA。利用反轉錄試劑盒，將獲得的總RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈。反轉錄體系為：5× PrimeScript RT Master Mix 2 μL，Total RNA4 μL，Rnase Free ddH2O 4 μL。反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.3.4半定量PCR 以反轉錄合成的cDNA為模板，同時對目的基因PD-1 和內參基因GAPDH 進行半定量PCR擴增。PCR反應體系為：ddH2O 7 μL，Premix Taq 10 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板1 μL。擴增條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，30個循環，72 ℃終延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。在凝膠成像分析儀中使用Image-Pro Plus觀察擴增得目的片段，并得出其灰度值(IOD)。

1.2.4血清sPD-1蛋白水平的測定 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清sPD-1的濃度，操作步驟分別參照檢測試劑盒說明書進行。簡要操作步驟如下：將sPD-1標準品依次稀釋，在96孔板中分別加入50 μL血清樣品或標準品，室溫孵育1 h，洗滌5次，然后加入50 μL酶標二抗室溫孵育1 h，洗滌5次，加入50 μL顯色劑避光孵育15 min，反應結束后加入50 μL終止液，酶標儀讀取450 nm吸光度值，根據標準品吸光度繪制標準曲線，然后計算血清sPD-1的濃度。sPD-1檢測試劑盒的檢測下限分別是1.2 pg/mL。

2 結 果

2.1應用半定量RT-PCR檢測臨床標本的結果 選擇GAPDH作為內參基因，半定量檢測HIV/AIDS患者與健康人群PBMCs中PD-1 mRNA表達水平。結果顯示，未治療組、治療組、健康組相對表達量均數分別為0.337 8±0.064、0.578 2±0.073和0.771 5±0.124，健康組與未治療組差異有統計學意義(P<0.001)，健康組與治療組、治療組與未治療組差異有統計學意義(P=0.031、P=0.043)(圖1)。

*，P<0.05； **，P<0.01； ***，P<0.001。圖1 PD-1 mRNA在健康人群及HIV/AIDS患者的相對表達量Fig.1 Relative expression of PD-1 mRNA in healthy and HIV / AIDS groups

2.2HIV/AIDS患者血清sPD-1表達水平 未治療組、治療組、健康組血清sPD-1濃度分別為42.22±2.21 ng/mL、38.24±2.79 ng/mL和29.88±1.41 ng/mL(圖2)。健康組與未治療組、治療組，治療組與未治療組分別具有統計學差異(P=0.008、P=0.040和P=0.020)。

圖2 HIV/AIDS患者與健康人群sPD-1含量Fig.2 Concentrations of sPD-1 in serum from HIV-infected individuals and healthy controls

2.3不同CD4+T淋巴細胞數的HIV/AIDS患者血清sPD-1的差異 國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊[1]建議成人/青少年HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細胞數低于350 個/mm3時要給予抗病毒治療。根據CD4+T淋巴細胞數高低，將HIV/AIDS患者治療組及未治療組分別再細分為<350 個/mm3和>350個/mm3亞組進行差異性分析。結果表明，未治療組、治療組CD4+T淋巴細胞數<350 個/mm3患者血清sPD-1水平均顯著高于CD4+T淋巴細胞數>350 個/mm3患者(P=0.035、P=0.047)。

圖3 不同CD4+T淋巴細胞數量水平的HIV/AIDS患者血清sPD-1Fig.3 Serum sPD-1 in HIV / AIDS patients with different CD4+T lymphocyte levels

3 討 論

近年來隨著對機體免疫調節機制認識的逐步深入，協同刺激分子在機體免疫中發揮的作用受到了越來越廣泛的重視。作為介導負性協同刺激信號的重要途徑，PD-1/PD-L1 通路在機體免疫應答過程中扮演著重要的角色，在免疫耐受、移植排斥、自身免疫性疾病以及腫瘤和慢性病毒感染等方面發揮了極為重要的生物學作用[2]。

PD-1與HIV-1感染具有緊密的聯系。謝榮華[3]等人的研究證實了PD-1是HIV 感染疾病進展的標志之一。另據報道，PD-1在預測HIV/AIDS患者體內病毒儲存庫大小中具有重要作用，其表達水平與病毒反彈及耐藥存在聯系[4]。此外，Edward[5]等證實，阻斷PD-1可抑制慢性HIV感染的人源化小鼠的病毒復制。本研究通過RT-PCR法對HIV/AIDS患者PBMCs中PD-1 mRNA的表達進行研究，與健康人群相比，PD-1 mRNA的表達下降，結果表明HIV感染可誘導PD-1轉錄水平的下調。

T細胞過度活化是HIV感染進程中的重要特征，不能僅根據膜型分子的表達情況來判斷患者的免疫狀態[6]，因為研究顯示，sPD-1參與T細胞活化的調控[7-10]。可溶性PD-1是由于PD-1的3號外顯子缺失(PD-1 △ex3)[11]經翻譯后形成的蛋白。據報道，sPD-1水平在類風濕性關節炎[12]、慢性肝炎[13]、系統性紅斑狼瘡[14]等病理狀態下明顯高于健康人群。本文研究結果表明，sPD-1水平未治療組>治療組>健康組，且CD4+T淋巴細胞數<350 個/mm3患者血清sPD-1水平均高于CD4+T淋巴細胞數>350 個/mm3患者(P=0.035、P=0.047)，高水平的sPD-1可對PD-1/PD-L1通路產生抑制。而抗病毒治療一方面抑制病毒復制，另一方面通過下調sPD-1水平的機制來恢復PD-1/PD-L1通路，使患者免疫功能得以部分重建。從這個角度講，使用可溶性PD-1的治療可能較抗PD-1抗體更有優勢[13]。

綜上，本文通過RT-PCR法與ELISA法證明了PD-1在HIV/AIDS患者mRNA表達下調，而sPD-1表達上調，兩者的變化表明其共同參與維持免疫系統平衡，為今后進一步研究PD-1 與HIV 感染的關系提供有價值的實驗數據，也為PD-1靶向診斷和治療HIV感染的策略提供了理論依據。

利益沖突：無

本文引用格式：陳琛, 趙長城, 王勇, 等. HIV/AIDS患者外周血程序性死亡受體-1的表達及臨床意義[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4):320-323，329. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.030