轉錄因子Eha直接調控遲緩愛德華菌的靶基因

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda，簡稱 Et)是革蘭氏陰性短桿菌，分布范圍很廣，同時，它可以感染爬行類、兩棲類、魚類及哺乳類等動物。Et菌對水產養殖業而言是一種重要的病原體，它可以引起多種魚類的感染[1]。遲緩愛德華氏菌的溶血相關基因(Et haemolysin activator gene，簡稱eha)是一種重要的轉錄調控基因[2]，本實驗采用RNA- Sequence技術比較在酸性條件下，ET-13野生株和eha基因缺失株轉錄組的表達，發現了147個差異表達的基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)[3]。本研究進一步用染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)[4]，尋找Et菌Eha直接調控靶基因，并結合ET13野生株和eha基因缺失株表型的差異，進一步研究Eha參與調控的Et菌屬抵抗巨噬細胞殺滅細菌的詳盡分子機制。

1 材料與方法

1.1Et 株 由南京農業大學陸承平教授贈予ET13菌株；本實驗室前期構建的eha基因缺失株；pBAD-lacZ購自南京鉑萊生物有限公司；pGEX-4T購自武漢三鷹公司(表1所示)。CHIP-IT○RExpress試劑盒購自ACTIVE MOTIF公司；本實驗于TaKara公司購試劑盒PrimeScriptTMRT Mix及SYBR○RPremix Ex TaTM。細菌培養基(Luria Broth, LB)；鼠源巨噬細胞RAW264.7為上海獸醫研究所王少輝博士惠贈；于Thermo購進胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)和細胞培養液(Dulbecco’s Minimum Essential Medium, DMEM)。

表1 本研究所用質粒和菌株

Tab.1 Bacterial species and plasmids in the study

Strain or plasmidDescriptionand/orgenotypeReferenceStrainE.coil DH5αK-12 cloning host strainSanYingCompanyEdwardsiella tarda strains(ET-13)Wild type;Colr;isolated from humanProf LuThe eha mutant ET-13(△eha)Deletion of eha; ColrDr.GaoET13-pACYC184Added an empty vector of pACYC184 ;ColrThis studyET13-tnaAAdded a vector of pACYC184-tnaA to ET13; ColrThis study△eha-tnaAAdded a vector of pACYC184-tnaA to △eha; ColrThis study△eha-pACYC184Added an empty vector of pACYC184 to △eha; ColrThis studyCehaET13Added a vector of pACYC184-eha to ET13;ColrThis studyCehaFlagET13Added a vector of pGEX-4T-ehaflag to ET13; ColrThis studyPlasmidspGEX-4T-flagAmpr; flag geneSanYing CompanypGEX-4T-ehaflagAmpr; ehaflag geneThis studypBAD-lac ZLacZ;Tetr;Bgl II和XbaⅠPoLaiCompanypBAD-Ptargetlac Ztarget gene promoter-LacZThis studypACYC184Tetr;CmrPoLaiCompanypACYC184-tnaAcontaining tnaA; Tetr; CmrThis study pACYC184-ehacontaining eha; Tetr; CmrThis study

1.2重組質粒 pGEX-4T-ehaflag的構建與鑒定 以ET13的基因組DNA為模板、引物ehaflag-F： CGGGATCCTTGGAATCGACATTGGGCTCG和ehaflag-R: GCGTCGACCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCATTTATTCTGTAAGTGAAT(劃線部分為Flag標簽序列)，擴增融合基因ehaflag。用SalI和BamH I 限制性內切酶對ehaflag片段和pGEX-4T載體雙酶切，將雙酶切后的片段進行連接，構建重組質粒并命名為pGEX-4T-ehaflag，進行測序，鑒定重組質粒。

1.3細菌EhaFlag融合蛋白的表達 采用電擊轉化法將重組質粒pGEX-4T-ehaflag導入eha基因缺失株，命名為Cehaflag ET13。挑取ET13、△eha和Cehaflag ET13三菌株的單菌落，并接種于15 mL LB液體培養基中，于搖床37 ℃過夜培養，參照說明步驟制備3菌株的蛋白樣品，用樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。釆用Flag標簽的單抗anti-Flag antibody(Sigma, USA)，單抗anti-DnaK (Cell Signaling Technology, USA)，用Western blot檢測Cehaflag ET13中EhaFlag融合蛋白的表達，DnaK作為內參。

1.4細菌的胞內生存實驗研究 以100∶1的感染復數MOI(multiplicity of infection) 用對數期生長的細菌感染鼠巨噬細胞，參照文獻方法[5]，橫坐標為培養時間(h)，每個細胞內的活菌數(CFU/cell)為縱坐標，繪制細菌胞內細菌數目和時間曲線。每個細胞內存活的活菌數目=規定時間分離的細菌數目/規定時間的細胞總數目，該試驗重復3次后進行統計學分析。

1.5 染色質免疫共沉淀

1.5.1細菌的固定 根據參照文獻[3]對數期ehaflag ET13株以pH=6.3 LB的酸性環境刺激2 h，按參考文獻[4]，加入甲醛，室溫固定，然后加入甘氨酸混勻，室溫孵育。洗滌，裂解菌體。

1.5.2超聲處理 參考文獻[4]， 超聲波將細菌的基因組DNA片段化至500～1 000 bp，超聲條件：200 W，5 s/20 s，共超聲6到7次使細菌懸液變澄清。

1.5.3除雜與抗體孵育 按參考文獻[4]的方法，為了降低非特異性結合，向上清液中加入預處理過的Protein G Magnetic Beads，孵育；依次加入CHIP反應體系各組分，實驗組加入anti-Flag antibody，對照組加入IgG antibody，孵育過夜。

1.5.4免疫復合物的沉淀與洗滌， 解交聯 按參考文獻[5]的方法，向過夜孵育的樣品中分別加入預處理過Beads，離心，洗滌。 加入蛋白酶K，分離結合在一起的DNA 和蛋白。

1.5.5熒光定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR) 以CHIP得到的DNA樣品為模板，根據RNA-Sequence的結果設計引物(表2)，參照試劑盒的說明書進行實驗操作，在ABI7300型熒光定量儀上進行PCR反應，內標參照為細菌中16S rRNA的表達量，采用2-ΔΔct法計算細菌在實驗組(anti-Flag antibody)基因轉錄水平相對對照組(IgG antibody)的倍數。

表2 用于qRT-PCR鑒定Eha直接結合基因的引物及產物大小

Tab.2 qRT-PCR Primer sequences and product sizes to identify the genes combined directly by Eha

Gene IDSequence(5′ to 3′)Product Size/bpUp RegulationETATCC_RS01565RS01565-F:CGTTGTACTTTCCGCCGCTATRS01565-R:ATCAGGAGCAGGGCAAAGG172ETATCC_RS01560RS01560-F:GGTGGCTGGCTGTGGAATTRS01560-R:GCGATAAGGAACGGCTGACT185ETATCC_RS15305RS15305-F:TGCACCCTTTCCGTACTCTRS15305-R:CGATCCGTTCTTCGATGATAT211ETATCC_RS01555RS01555-F:GCCAATGCTTGAATGACCCRS01555-R:GTAAGTCCTCCTCCGTCTGTG360ETATCC_RS09960RS09960-F:TCGCCATCTGGTGCGTCTARS09960-R:AACAGGGCGGTCAGGGTCA363表2(續)Gene IDSequence(5′ to 3′)Product Size/bpETATCC_RS05005RS05005-F:GGCGTCGGTGCCTTCTTCTRS05005-R:GCCTGGTCAGCCACGAACT260ETATCC_RS16600RS16600-F:CGCCTGTTAGTCGGGTTGGRS16600-R:AGATGGCGCATCGGCTCGC194ETATCC_RS02310RS02310-F:AAGGCGGCTTTCCTACCCTRS02310-R:TGACAACTGCGGCACTCAATA175ETATCC_RS16810RS16810-F:ATCAACACCTGCGTCTCACCRS16810-R:GCGAATCTCATACTTCCCACT155ETATCC_RS08150RS08150-F:ATGTCGCAGCACGCCCTAGRS08150-R:CGGTTGGCGGTAGCTGACT246ETATCC_RS10370RS10370-F:ACTGGTCGGCTTCGATGTGRS10370-R:GGTGATGTAGGGATCGGAGAA193ETATCC_RS06805RS06805-F:CTGGTGATTAACAGTGGCTRS06805-R:CGCTCAGATTGGCGTAGTT352ETATCC_RS06800RS06800-F:GCCATCTGTCCCTTGCTATRS06800-R:CGATAACGAAATAAGCACC225ETATCC_RS05810RS05810-F:TGACTCCCAGCGAGACAACGRS05810-R:TCACGATTCAGGGTCAACACG315ETATCC_RS00100RS00100-F:GTTGGGCAAGGGTTGGAATRS00100-R:CCGACTAACAGGGCGAAGAC168ETATCC_RS14045RS14045-F:CGGAGACGCTTGAGGCTTTGRS14045-R:CAGACGATAGGCGAAACCAT332ETATCC_RS05805RS05805-F:TCTTTCATCCAAGCCATTCTGRS05805-R:GGCGATGTTGCCACGGATA144ETATCC_RS14760RS14760-F:GCCGCAGCAGTAGCTCTATRS14760-R:ATCGCTGAACTCGGTAGCC372ETATCC_RS11570RS11570-F:TCGCCCGTGATTTCATTCG

F: forward primer, R: reverse primer.

1.6構建靶基因啟動子和LacZ融合質粒及檢測β-半乳糖苷酶 以ET-13基因組DNA為模板，擴增靶基因的啟動子區(引物見表3)，將該片段插入 pBAD-lacZ 載體中，構建了靶基因的啟動子載體 pBAD-P靶lacZ，然后將這些載體分別電擊導入 ET-13野生株和eha基因缺失株中。檢測對數期細菌以pH=6.3 LB的酸性環境刺激2h的β —半乳糖苷酶活性。

表3 基因啟動子區的產物大小和引物序列

Tab.3 Primer sequences and product sizes to amplify the promoters of genes by PCR

Gene IDSequence(5′to 3′)Product Size/bpETATCC_RS01555CAGATCTGCGGCAGGAATGCCAAATTA CTCTAGATATCCGGTAACGCACCCG220ETATCC_RS08025CAGATCTTGGGGTTCCTTAGTGCGATGCTCTAGATCCCATGTCTCACCGCTTTG285ETATCC_RS14735CAGATCTCAGTGAGAGGACCAATGGGA CTCTAGAGCGCGGCCTGATAGACTC280ETATCC_RS10595CAGATCTTCGCCTACATCCCTCAAAGTTCTCTAGAGTCCCACCATGATGACACGA304ETATCC_RS15225CAGATCTCCGGAGGTCTCCGTCAGTTACTCTAGACCGGCGGCGGGATAAG265ETATCC_RS06125CAGATCTTTTTATTTGGTGCGTCGGCAGCTCTAGACCGCACGCCGTAGAAAGAG450ETATCC_RS10185CAGATCTTTGGATGTCCTTGATATGGTCTTCTCTAGAATAATCAGGCATAGCATTTGCATT420ETATCC_RS00925CAGATCTTCTTCGCTCTACAATTATTAGGGTCTCTAGAGCAACTAACATTTTCCTATAGCACG300ETATCC_RS14855CAGATCTGGCCCACATACCGAGAATGACTCTAGAGCAAGTTAGGCGAGTAACGC464ETATCC_RS07650CAGATCTAAATGGAGCAATTACGGCGGCTCTAGAAGCAGCTGTATCGTTGCGG141

1.7SDS-PAGE檢測細菌外膜蛋白表達 將相同數目對數期的 ET-13野生株和eha基因缺失株超聲波破碎，離心，取上清，再超速離心， 沉淀為細胞膜成分。用BCA法測定蛋白濃度，取等量的蛋白樣品，進行10% SDS-PAGE 蛋白電泳檢測，考馬斯亮蘭 R-250 染色液中染色，脫色后觀察結果。

1.8SDS-PAGE檢測細菌鞭毛蛋白表達 將相同數目對數期的ET-13野生株和eha基因缺失株，離心沉淀，提取細菌鞭毛蛋白，分別溶于5 mL PBS，加樣15 μL /每孔，進行SDS-PAGE檢測，方法同1.7。

1.9統計學分析 使用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行分析兩組數據之間的比較采用t檢驗，當P<0.05時表示結果有統計學差異。

2 結 果

2.1細菌EhaFlag融合蛋白的表達 結果如圖1所示，可以在Cehaflag ET13株中檢測到大約21 kDa的條帶，而在對照組的ET-13野生株和eha缺失株中未檢測出條帶，說明在Cehaflag ET13株中EhaFlag的融合蛋白是可以表達的。

1.Cehaflag ET13株 2. ET13野生株 3.eha基因缺失株圖1 Western blot檢測在Et菌中EhaFlag融合蛋白的表達Fig.1 EhaFlag fusion protein of expression in Et inspected by Western blot

2.2細菌EhaFlag融合蛋白活性的檢測 結果如圖2所示，Cehaflag ET13株與野生型ET-13株在巨噬細胞內的生存能力無明顯差異，它們和eha基因缺失株的生存能力分別有明顯差異(P<0.05)，說明Cehaflag ET13株中表達的EhaFlag融合蛋白與ET-13野生株中表達的Eha蛋白具有一樣生物活性。

圖2 比較ET13與Cehaflag ET13在巨噬細胞內活差異Fig. 2 Comparison of the differences between the intracellular survival rates of Cehaflag ET13 and the one of the wild type ET13

2.3染色質免疫共沉淀超聲條件的摸索 結果如圖3所示，200 W，Plus 5 s/10 s，超聲6或7次后DNA片段在500～1 000 bp的集中程度更高。

A 1-8:200W，Plus10s/30s的超聲2、3、4、5、6、7、8、9次; B 1-8: 200W，Plus 5s/10s的超聲4、5、6、7、8、9、10、11次圖3 檢測不同超聲條件下ET13細菌基因組DNA的片段化程度Fig.3 Fragmentation degree of bacterial genomic DNA of ET13 on different ultrasonic conditions

2.4尋找Eha蛋白直接結合的基因 qRT-PCR 檢測CHIP實驗獲得的DNA樣品中基因的量，在實驗組(anti-Flag antibody)與對照組(IgG antibody)之間相差10倍以上即為轉錄調控因子Eha的基因。結果如圖4所示，CHIP共富集10個基因的啟動子片斷分別編碼：鐮刀菌酸抗性蛋白(ETATCC_ RS01555)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(ETATCC_RS08025)、分支酸合酶(ETATCC_ RS14735)、 rRNA胞嘧啶-C5-甲基轉移酶(ETATCC_RS10595)、厭氧C4二羧酸轉運蛋白DcuA(ETATCC_RS15225)、異檸檬酸裂合酶CitC(ETATCC_RS06125)、熱休克蛋白IbpB(ETATCC_RS00925)、鞭毛鉤蛋白flgK(ETATCC_RS14855)、色氨酸酶(ETATCC_RS07650)和一個未知功能蛋白(ETATCC_ RS10185)。

圖4 qPCR鑒定轉錄因子Eha直接結合的基因Fig.4 qPCR used to identify the genes combined immediately with the transcriptive factor Eha

(*P<0.05;**P<0.01)圖5 比較野生型ET13株和eha基因缺失株中 β-半乳糖苷酶活性的差異Fig.5 Comparison of the differences between the β-galactosidase activities of the wild type ET13 and the ones of the eha mutant

2.5檢測eha基因對靶基因啟動子直接調控作用 對數期細菌pH=6.3的酸性環境刺激2 h后，比較ET13野生株和eha基因缺失株中pBAD-P靶lacZ的β-半乳糖苷酶活性的差異，結果如圖5所示，在該條件下，eha基因直接正調控靶基因編碼的蛋白是：分支酸合酶(ETATCC_ RS14735)、色氨酸酶TnaA(ETATCC_ RS07650)、厭氧C4二羧酸轉運蛋白DcuA(ETATCC_ RS15225)、熱休克蛋白IbpB(ETATCC_ RS00925)和鞭毛鉤蛋白flgK(ETATCC_RS14855)。

2.6比較野生株和eha基因缺失株外膜蛋白表達的差異 分別提取野生株和缺失株的外膜蛋白，SDS-PAGE 蛋白電泳檢測，結果見圖 6。在加等量蛋白的情況下，野生株約 17 kDa、30 kDa 和 37.7 kDa外膜蛋白的表達水平明顯高于eha基因缺失株的表達水平，其中37.7 kDa的大小和厭氧C4二羧酸轉運蛋DcuA1的大小一致。

M. 蛋白marker; 1.野生型ET-13; 2.eha基因缺失株;3. 互補株圖6 用SDS-PAEG比較ET13、△eha和互補株中外膜蛋白的表達差異Fig.6 Comparison of the differences between the out membrane proteins expressed by the wild type ET13 and the one did by the eha mutant by SDS-PAEG

2.7比較野生株和eha基因缺失株鞭毛蛋白表達的差異 分別提取ET13、互補株和△eha的鞭毛鉤蛋白，進行蛋白電泳檢測，結果如圖所示(圖7)，E.tarda鞭毛蛋白的分子量為54 kD，圖中的條帶主要位于43 kD和56 kD之間，與鞭毛鉤蛋白的分子量一致。因此，當三種菌株上樣量相同時，野生株與互補株的鞭毛鉤蛋白的表達量接近且都高于eha缺失株。

M蛋白marker；1. 野生型ET13；2. 互補株；3.eha基因缺失株圖7 SDS-PAEG比較ET13、△eha和互補株的鞭毛鉤蛋白flgK表達差異Fig.7 Comparison of the differences between the flagellar hook protein flgK expressed by the wild type ET13 and the one did by the eha mutant by SDS-PAEG

2.8eha基因調控tnaA基因影響Et菌胞內生存的作用 結果顯示，Et13-pACYC184、Et13-tnaA、△eha-tnaA和△eha-pACYC184株在巨噬細胞內的生存曲線隨培養時間呈上升趨勢，結果表明以上菌株均可在巨噬細胞內存活。并且與Et13-pACYC184菌株相比，繼續培養6 h以后，Et13-tnaA組胞內存活的細菌數量呈增高(P<0.05)，△eha-pACYC184組細菌數目明顯降低(P<0.05)，表明eha基因和tnaA基因均影響Et13在巨噬細胞內的繁殖速率。而和△eha-pACYC184組相比， △eha-tnaA組細菌數量增高(P<0.05)；和Et13-pACYC184組相比，△eha-tnaA組細菌數量差異沒有統計學意義(P>0.05)，結果提示，tnaA基因可以回復eha基因缺失對Et13胞內繁殖速率的影響。

圖8 eha基因調控tnaA基因影響ET13株在巨噬細胞胞內的生存率(**P<0.01)Fig. 8 Theehagene regulatedtnaAgenes to affecte the intracellular survival rates of ET13 strains within macrophages

3 討 論

我們通過轉錄組測序技術，發現 ET-13 野生株與eha缺失株間的差異表達基因，但其中有些基因是eha直接調控的靶基因，而有的基因是受環境等因素影響或者eha間接調控的基因。本實驗借助免疫共沉淀實驗技術(CHIP)，研究體內DNA與蛋白質的相互作用，從而在細胞的內環境條件下，找出能夠與Eha蛋白相結合的靶基因。此技術的關鍵是需要一種特異性好的抗體才能有效地富集目標蛋白。通過檢測Eha融合蛋白的功能發現，Flag標簽并會不干擾Eha蛋白的功能。本實驗借助商品化的Flag標簽替代Eha的單抗，從而實現對融合蛋白Eha-Flag蛋白的高度富集， 最終篩選出5個可以和Eha蛋白直接結合的基因。此外，通過直接檢測轉化入pBAD-P靶lacZ的ET-13和△eha株中的β-gal活性的差異，說明eha基因對靶基因的啟動子區具有直接的調控作用。此外，我們通過比野生株和缺失株表型的差異，如厭氧C4二羧酸轉運蛋DcuA1和鞭毛鉤蛋白FlgK，驗證eha基因對靶基因的啟動子有直接的調控作用。

Eha直接調控靶基因編碼的蛋白，如分支酸合酶是莽草酸通路中的一種酶，存在于大多數原核生物中，能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化為分支酸，是該通路的最后一步。 由于分支酸是合成芳香族氨基酸的前體，對于細菌的生長繁殖至關重要[6]。C4-二羧酸鹽作為碳和電子受體分子，參與非糖物質代謝。在空腸彎曲桿菌中，C4-二羧酸鹽轉運子dcuA和dcuB由雙組分系統RacR / RacS直接調節，響應缺氧氧氣環境和硝酸鹽的存在[7]。小分子熱休克蛋白IbpA和IbpB與脅迫條件下細胞內蛋白的穩態和生存有著密切聯系，具有分子伴侶功能、穩定細胞結構功能和調節細胞凋亡功能。巨噬細胞吞噬非致病大腸埃希菌，產生ROS(Reactive Oxygen Species)殺死細菌時，IbpAB提供一定的保護作用。IbpB的靶蛋白，如色氨酸降解酶、延伸因子EF-Tu和過氧化氫酶等，并發現IbpB可以穩定這些靶蛋白[8]。FlgK和FlaL共同構成鞭毛鉤環狀結構，是鞭毛形成并發揮功能的重要組成部分，ETATCC_RS14855鞭毛鉤絲 FlgK，鞭毛是細菌的運動器官，鞭毛的運動方向受到細菌趨化作用系統的控制，鞭毛對于細菌的環境適應性及致病性至關重要[9]。色氨酸酶能夠催化色氨酸形成吲哚和丙酮酸，直接參與氨基酸的代謝過程，其中吲哚的產生可以參與很多細菌的生理活動調節，比如抗藥性、抗酸性、毒力、運動性、生物膜形成等[10]。這些結果說明，Eha可以通過調控靶基因，影響Et菌物質和能量代謝過程，抵御巨噬細胞殺菌能力。

利益沖突：無

本文引用格式：田暢, 劉念, 鄭恩金, 等. 轉錄因子Eha直接調控遲緩愛德華菌的靶基因[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4):299-310. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.027