韓春雨的“基因剪刀”又復(fù)活了？

杜瑋

4月4日，美國冷泉港實驗室運(yùn)營的網(wǎng)站bioRxiv發(fā)表論文稱，普渡大學(xué)的科研人員發(fā)現(xiàn)了一種名為NgAgo的蛋白能切割DNA（脫氧核糖核酸）， 并可以提高大腸桿菌體內(nèi)基因同源重組的效率。bioRxiv是免費向生物學(xué)家開放的預(yù)印本文獻(xiàn)庫，也就是說，發(fā)表在上面的文章都是尚未獲得同行評議的作者原始文稿。

韓春雨。

在基因編輯過程中，同源重組被視為細(xì)胞常用的修復(fù)手段，基因剪刀斷開DNA鏈條的行為，會刺激同源重組的發(fā)生，如果再提供外源供體，則能完成DNA序列的交換。三個月前，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室的研究團(tuán)隊也在國際期刊《核酸研究》上發(fā)文，同樣稱NgAgo能促進(jìn)幾種細(xì)菌體內(nèi)的基因同源重組，可視為潛在的基因編輯工具。

NgAgo，正是兩年多以前，讓河北科技大學(xué)副教授韓春雨卷入巨大輿論漩渦的物質(zhì)。如今，伴隨著兩篇新論文的發(fā)表，由韓春雨首次發(fā)現(xiàn)并命名的NgAgo能否作為基因編輯的新剪刀，再度成了被關(guān)注的焦點。

說NgAgo繞不開韓春雨

2016年5月2日，《自然》雜志子刊《自然·生物技術(shù)》刊登了一篇名為《DNA引導(dǎo)的NgAgo蛋白可用作基因編輯工具》的文章，作者為河北科技大學(xué)韓春雨團(tuán)隊，這是NgAgo首次被提出。文章稱，NgAgo能在向?qū)NA的指引下，對目標(biāo)基因有效切割，可用于對人類細(xì)胞的基因編輯。

這篇文章發(fā)表后，在種種外界因素的推動下，隨即在國內(nèi)引發(fā)轟動效應(yīng)，某些國內(nèi)專家和媒體稱之為“諾獎級”的發(fā)現(xiàn)。同時，NgAgo被視為新的基因編輯技術(shù)，可比肩目前世界上應(yīng)用最廣泛的基因編輯工具CRISPR/Cas9。

基因編輯，指人為對DNA片段進(jìn)行有目的的改造，包括插入、敲除基因等操作，使其序列發(fā)生變化。基因編輯和電腦上編輯一份文檔類似，只不過，其操作對象是直接影響生物體特質(zhì)的終極密碼——DNA。通常，基因編輯分為剪開與修復(fù)兩個步驟。因此，要想進(jìn)行基因編輯，首先要有把好“剪刀”。

目前，科學(xué)家們用得最順手的基因剪刀就是CRISPR/Cas9，其開發(fā)者是美國麻省理工學(xué)院華裔科學(xué)家張鋒和加州大學(xué)伯克利分校教授詹妮弗·杜德娜等。實際上，CRISPR/Cas9最初是細(xì)菌抵御外敵的防御系統(tǒng)：當(dāng)有病毒或外來DNA首次入侵時，CRISPR/Cas9就會剪切一段帶有入侵者身份特質(zhì)的DNA（核糖核酸），將其記錄在案，等外敵再次來犯時，CRISPR/Cas9會依據(jù)之前記錄的DNA信息，轉(zhuǎn)錄出一段起著向?qū)ё饔玫腞NA，指引自己對來敵精準(zhǔn)識別，準(zhǔn)確打擊。就是這樣一套系統(tǒng)，被科學(xué)家們用作基因編輯的工具。

但CRISPR/Cas9也有缺點：其剪切點一定要位于一段處于特定位置、名為PAM序列的上游，這意味著CRISPR/Cas9的工作范圍并不能無死角、全覆蓋。而引導(dǎo)其剪切的RNA還有著容易變身的特點，這同樣會影響到剪切的準(zhǔn)確度。因此，研發(fā)更可靠、更準(zhǔn)確的新剪刀成了科學(xué)家們的目標(biāo)。這一背景下，名為Argonaute（簡稱Ago）的蛋白家族開始相繼登場。

與CRISPR/Cas9相似，Ago蛋白同樣是生物體的防御系統(tǒng)。最初，人們發(fā)現(xiàn)，真核生物體內(nèi)的Ago蛋白能降解外來的RNA，進(jìn)而又發(fā)現(xiàn)，來源于原核生物的Ago蛋白可以消滅入侵的DNA。從形態(tài)上來說，原核與真核生物的區(qū)別在于細(xì)胞核有沒有核膜，原核生物是指一類細(xì)胞核無核膜包裹的原始單細(xì)胞生物，真核生物則涵蓋了包括人類在內(nèi)的所有動植物等生命體。

2014年，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)教授約翰·范德歐斯特在原核生物的Ago蛋白家族中，發(fā)現(xiàn)一種名為TtAgo的蛋白能與具有向?qū)ё饔玫腄NA結(jié)合，在65°C條件下，切割目的DNA。但顯然，高溫限制了其發(fā)揮更大作用的潛力。

業(yè)界一度認(rèn)為，韓春雨的研究突破性地解決了這一弊端。通過對比篩選，他發(fā)現(xiàn)另一種來源于格氏嗜鹽堿桿菌的Ago蛋白，并將其命名為NgAgo。通過實驗證實，這種蛋白能在37°C常溫下，結(jié)合向?qū)NA，實現(xiàn)基因編輯。這意味著NgAgo在人類疾病治療、生物制藥等領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。而相比CRISPR/Cas9，NgAgo還有著不特定依賴于PAM序列、以DNA 為向?qū)Р灰资Ш兔摪小⑷蒎e率低、效率高等一系列優(yōu)點。

2016年5月8日，新媒體平臺“知識分子”，以《韓春雨：“一鳴驚人”的中國科學(xué)家發(fā)明世界一流新技術(shù)》為題，報道了韓春雨其人與他的研究。“知識分子”在這篇注明為“特稿”的文章前加了一段編者按，其中寫道：“令國人激動的是，韓春雨在河北科技大學(xué)條件不好、經(jīng)費缺乏、人員很少的情況下做出的研究，優(yōu)于世界一流的麻省理工、哈佛、斯坦福。《知識分子》主編、北京大學(xué)教授饒毅將韓春雨推介給編輯部，在此我們特別刊出專訪，以饗讀者。”

此后，國內(nèi)媒體蜂擁而上，對韓春雨的研究成果進(jìn)行報道。韓春雨先后被評為河北省科協(xié)副主席、河北省最美教師、國家“中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才”候選人、“長江學(xué)者獎勵計劃”候選人、2016年度高校享受政府特殊津貼人員等。2016年8月，河北省發(fā)改委還批復(fù)并“原則同意”了估算總額達(dá)2.24億元的河北科技大學(xué)基因編輯技術(shù)研究中心的工程建設(shè)項目。

質(zhì)疑聲與贊譽(yù)幾乎同時而至。在其論文發(fā)表后不到20天，現(xiàn)任美國普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系教授、當(dāng)時在清華大學(xué)任教的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家顏寧在微博上首次提出韓春雨論文結(jié)果的可重復(fù)性存在問題。

此后，類似質(zhì)疑在未名空間、知乎、百度貼吧等論壇上出現(xiàn)。至2016年9月，饒毅與中科院院士邵峰聯(lián)名致信河北科技大學(xué)校長，稱“宜謹(jǐn)慎對待韓春雨及其研究成果”，并建議成立專家委員會，核實韓春雨研究成果。當(dāng)年10月，北大生科院教授魏文勝等13名國內(nèi)生物學(xué)家聯(lián)名在媒體上公開發(fā)聲，表示無法重復(fù)該實驗結(jié)果，希望韓春雨公開所有原始數(shù)據(jù)，呼吁學(xué)校及相關(guān)方介入調(diào)查。

2016年11月，《自然·生物技術(shù)》編輯部表示，正在調(diào)查該論文。之后，韓春雨給《自然·生物技術(shù)》編輯部補(bǔ)充了相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。

2017年1月，國家知識產(chǎn)權(quán)局撤回了韓春雨團(tuán)隊以Ago為核心的基因編輯技術(shù)專利。據(jù)介紹，目前，該團(tuán)隊以國際專利形式重新提交申請，并處于公開狀態(tài)。同年8月，由于一直沒有重復(fù)出實驗結(jié)果，韓春雨團(tuán)隊撤回論文。《自然·生物技術(shù)》編輯部發(fā)表了《是該數(shù)據(jù)說話的時候了》的社論稱，“我們現(xiàn)在確信韓春雨的撤稿決定是維護(hù)已發(fā)表科研記錄完整性的最好做法。”

之后，韓春雨團(tuán)隊繼續(xù)尋找論文結(jié)果不能重復(fù)的原因。時隔一年后，河北科技大學(xué)發(fā)文稱，韓春雨團(tuán)隊不存在主觀造假。但依據(jù)有關(guān)規(guī)定，取消韓春雨所獲得的榮譽(yù)稱號，終止韓春雨團(tuán)隊承擔(dān)的科研項目并收回科研經(jīng)費。韓春雨團(tuán)隊回應(yīng)說，實驗設(shè)計存在缺陷、研究過程存在著不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯栴}。

兩項新發(fā)現(xiàn)與基因剪刀的未來

雖然“韓春雨事件”告一段落，但由他首先提出的NgAgo能否作為基因編輯工具仍無定論。

早在2016年11月，南通大學(xué)神經(jīng)再生重點實驗室副教授劉東與復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員王永明在《自然》雜志子刊《細(xì)胞研究》上發(fā)表了國內(nèi)第二篇關(guān)于NgAgo的文章。文章稱，用NgAgo可以“敲低”斑馬魚基因，導(dǎo)致其眼部發(fā)育缺陷。但由于“敲低”只是使基因表達(dá)降低，并沒有改變基因序列，因此，談不上“編輯”。而由于研究對象不同，劉東等人稱，其研究也“不能對此前韓春雨的結(jié)論證實或證偽”。

相比之下，最近發(fā)表的兩項關(guān)于NgAgo的新研究似乎帶給人們更多希望。

在美國普渡大學(xué)的研究中，NgAgo首先被證實在體外實驗中具有切割DNA的能力。更進(jìn)一步，研究人員發(fā)現(xiàn)，NgAgo上兩個名為PIWI和RepA的部位都能獨立切割DNA。但與韓春雨結(jié)論不同的是，在普渡大學(xué)開展的體外實驗中，NgAgo切割時，并沒有和本該配對的向?qū)NA結(jié)合。負(fù)責(zé)這項研究的普渡大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程助理教授凱文·所羅門在接受《中國新聞周刊》采訪時推測說，這有可能是NgAgo事先已結(jié)合了DNA在復(fù)制過程產(chǎn)生的其他碎片DNA片段，充當(dāng)向?qū)А?/p>

而在大腸桿菌的體內(nèi)實驗中，NgAgo被證明能結(jié)合向?qū)NA，并依靠其切割能力，提升大腸桿菌同源重組的效率。今年1月，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究同樣證明：在巴氏桿菌和大腸桿菌體內(nèi)，NgAgo能提升基因同源重組的效率。但與普渡大學(xué)和韓春雨的研究不同，該論文作者華中農(nóng)大動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室教授張安定、金梅林等人觀察到，NgAgo對同源重組的促進(jìn)，是通過NgAgo的PIWI部位與一種助力同源重組的酶RecA的相互作用。“當(dāng)然，我們不排除它兩種原理都在起作用。”張安定在接受《中國新聞周刊》采訪時說。

但需要注意的是，無論是華中農(nóng)大還是普渡大學(xué)的研究，目前都聚焦的是NgAgo在原核生物中的切割作用。“我們并沒有打算重復(fù)韓春雨論文中的研究結(jié)論，也就是在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯。”所羅門說，“現(xiàn)在說NgAgo能否適用于人類細(xì)胞基因編輯為時尚早，我們能夠說的是，這是又一個能提升細(xì)菌中基因編輯的工具，對生物燃料的生產(chǎn)、制藥等方面能發(fā)揮作用。”

事實上，在韓春雨論文結(jié)果發(fā)表之初，國內(nèi)也曾一度掀起跟風(fēng)研究熱潮。據(jù)某不愿具名的業(yè)內(nèi)人士稱，國內(nèi)六七家在這一領(lǐng)域較有實力的科研機(jī)構(gòu)此前都對NgAgo很感興趣。但在韓春雨論文被熱烈追捧又遭到強(qiáng)烈質(zhì)疑后，這些研究者又逐漸退出，基本不再涉足該研究領(lǐng)域。相比之下，在世界范圍內(nèi)，對于NgAgo乃至更大范圍的Ago蛋白家族的研究，仍進(jìn)展不斷。

今年2月，加州理工學(xué)院生物工程系教授阿列克謝·阿拉溫在bioRxiv上發(fā)表論文稱，源于丁酸梭菌的CbAgo具有高活性，可用于在中等溫度下切割單鏈和雙鏈DNA。阿拉溫進(jìn)一步表示，在37℃條件下，CbAgo可能在真核細(xì)胞中具有活性。前文提到的荷蘭瓦赫寧根大學(xué)教授范德歐斯特近期也在bioRxiv發(fā)表了類似的研究成果。不過，他對《中國新聞周刊》回復(fù)稱，“迄今為止，我們還沒有用CbAgo進(jìn)行人類細(xì)胞基因組的編輯，如果應(yīng)用，還需要更多的優(yōu)化”。

國內(nèi)某權(quán)威科研院所一名長期研究Ago蛋白家族的研究人員稱，當(dāng)初，韓春雨的研究只是該領(lǐng)域眾多科研成果中的一項，即使文章結(jié)論成立，也并無特別值得關(guān)注之處。他的研究之所以引發(fā)轟動效應(yīng)，主要是媒體的炒作。在她看來，眼下，Ago蛋白用作基因編輯工具還不太合適，“就像拿一把非常鈍的刀子去切肉一樣”，“但不排除以后大家想到什么樣的辦法對蛋白進(jìn)行一個非常大的改造，或者兩三個蛋白一起作用，研究人員應(yīng)該想一些更加有用的辦法。一旦基礎(chǔ)研究有了突破，應(yīng)用上的突破也會很快跟上。那么究竟突破在哪里？我覺得還得給大家更多時間。”

前述不愿具名的業(yè)內(nèi)人士則表示，從目前國內(nèi)外最新的研究成果來看，NgAgo有其科研價值，“顯現(xiàn)出來很多的效果都是值得我們?nèi)パ芯康摹薄ＫJ(rèn)為，相較國外的持續(xù)跟進(jìn)，如果國內(nèi)因為韓春雨當(dāng)年被“捧殺”而不再關(guān)注這一研究，將在這一領(lǐng)域處于落后被動的地位。