利用CRISPR/Cas9和piggyBac實(shí)現(xiàn)果蠅基因組無縫編輯

王玨，黃娟，許蕊

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利用CRISPR/Cas9和實(shí)現(xiàn)果蠅基因組無縫編輯

王玨，黃娟，許蕊

南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，南京 211166

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)是第三代基因組編輯技術(shù)。在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9核酸內(nèi)切酶作用于特定基因組序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)，利用同源定向修復(fù)(homology-directed repair, HDR)可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的特異性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。傳統(tǒng)的技術(shù)方案將CRISPR/Cas9技術(shù)與Cre/loxP或FLP/FRT系統(tǒng)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)高效的基因打靶，也易于移除打靶過程中引入的篩選標(biāo)記。然而，篩選標(biāo)記移除過程中會(huì)在基因組中殘留34個(gè)堿基的標(biāo)簽序列。因此，對(duì)基因組進(jìn)行精確編輯的同時(shí)不引入無關(guān)序列仍有一定難度。在人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因組編輯中，CRISPR/Cas9技術(shù)和轉(zhuǎn)座酶聯(lián)用的兩步法策略能夠?qū)崿F(xiàn)這一目標(biāo)：首先運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)，利用同源定向修復(fù)原理引入基因突變及篩選標(biāo)記，然后利用轉(zhuǎn)座酶將篩選標(biāo)記精確移除。借鑒該方法的技術(shù)原理，本研究對(duì)果蠅()基因進(jìn)行了無縫編輯(seamless genome editing)，成功將該基因第18外顯子上第21位的酪氨酸(tyrosine, Y)突變?yōu)榘腚装彼?cysteine, C)，且測(cè)序結(jié)果顯示基因組中除設(shè)計(jì)位點(diǎn)之外并無其他外源序列殘留。CRISPR/ Cas9技術(shù)和轉(zhuǎn)座酶聯(lián)用策略為果蠅基因組的精確編輯提供了更多選擇。

果蠅；無縫基因組編輯；CRISPR/Cas9；

利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)獲得基因突變體，并檢測(cè)基因突變?cè)斐傻挠绊懯茄芯炕蚬δ艿闹匾侄巍RISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated pr-otein 9)技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)基因打靶提供了簡(jiǎn)單高效的方法[1~3]。在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9核酸內(nèi)切酶可作用于特定基因序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)，誘發(fā)內(nèi)源性非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源定向修復(fù)(homology-directed repair, HDR)。……