組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸肝細胞毒性相關作用機制研究

那存烏力吉，達嘎呼

0 引言

丙戊酸(Valproic acid，VPA)是一種支鏈短鏈脂肪酸，是治療癲癇和雙相情感障礙的常用藥物之一[1]。在治療癲癇中，VPA是一種有效的廣譜抗驚厥藥，用于治療原發性全身強直-陣攣性、無癥狀和部分性癲癇[2]。VPA具有嚴重的不良反應，如肝毒性[3]、骨髓抑制[4]、骨細胞產生減少和骨軟化。其中肝毒性主要表現為肝細胞脂肪變性及細胞凋亡[5]，VPA肝毒性的機制尚不清楚[6]。此外，VPA是一類新型組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)抑制劑，促進組蛋白乙酰化，使染色質采取松散的結構，促進各種轉錄因子的結合，影響基因的轉錄與表達。研究認為，VPA的HDAC抑制活性與多種癌癥相關基因的表達增加有關，可抑制細胞生長和增加細胞凋亡[6]。相關研究發現，VPA處理肝細胞后，AKT1基因表達改變明顯[7]，而且AKT1的下調與線粒體異常有關。線粒體異常是引起細胞凋亡的重要機制之一。本研究探討VPA是否通過影響PI3K/AKT/mTOR通路來影響線粒體功能，從而引起細胞凋亡，并使用HDAC抑制劑曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)研究這種效應是否與其HDAC抑制劑活性相關，為了解和防治VPA肝毒性提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞株 HepG2人肝癌細胞系，購于上海中科院，37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養，培養液為含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基。

1.2 實驗試劑 胎牛血清，RPMI-1640(GIBICO，美國)，MTS試劑盒(Promega，美國)，DMSO，TSA(Sigma，美國)，抗p-PI3K，PI3K，p-AKT，AKT，p-mTOR，mTOR，LC3B，p62/SQSTM1，pre-caspase-3，cleaved-caspase-3，Bcl-2，Bax，GAPDH抗體(Cell signaling technology，美國)，抗兔，抗小鼠，抗山羊HRP二抗(中杉金橋，中國)，ECL試劑盒(Thermo Fisher，美國)，JC-1試劑盒(碧云天，中國)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(Becton，Dickinson and company，美國)。

2 方法

2.1 處理與分組 取對數生長期HepG2細胞，種植于細胞培養板。VPA濃度為0、100、500 μmol/L，1、5、10 mmol/L；TSA濃度為0、50、100、500 nmol/L，1、5 μmol/L。處理時間為24 h。

2.2 細胞活性檢測 用MTS試劑盒檢測細胞活性。取對數生長期HepG2細胞種植于96孔板，種植密度是4×104個細胞/孔，細胞生長24 h后加藥處理。處理后棄去原培養液，加入新鮮完全培養液100 μl/孔，加入試劑20 μl/孔，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育2 h。使用分光光度儀讀取490 nm處吸光度值。MTS與活細胞線粒體中的多種脫氫酶反應，形成甲瓚產物，490 nm吸光度值大小與活細胞數呈正相關。

2.3 細胞凋亡檢測 用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞凋亡情況。細胞加藥處理后，用PBS清洗1次，然后用0.025%胰酶，37 ℃ 消化5 min，將細胞轉移至離心管中，1 000 g離心5 min，分別加入Annexin V-FITC和PI染色，30 min內使用流式細胞儀檢測。綠色熒光素FITC標記的Annexin V可以與細胞膜組分磷脂酰絲氨酸結合，指示死亡細胞。PI是核酸染料，不能通過完整細胞膜，能通過凋亡晚期細胞或死細胞膜，對細胞核進行染色。活細胞：Annexin V和PI都不能染色；早期凋亡細胞：Annexin V可以染色，PI不能染色；晚期凋亡或死細胞：Annexin V和PI都能染色。

2.4 線粒體膜電位檢測 細胞經處理后，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可以用PBS或其他適當溶液洗滌細胞1次，加入1 ml細胞培養液。加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37 ℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 ml JC-1染色緩沖液(5×)加入4 ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴中。37 ℃孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。

加入2 ml細胞培養液，用熒光顯微鏡觀察，拍攝。檢測JC-1單體時可以把激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm；檢測JC-1聚合物時，把激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針。當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化，用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

2.5 免疫印跡檢測 細胞加藥處理后，棄去培養液，用PBS清洗一遍，用含有NaVO4、NaF cocktail蛋白酶抑制劑、PMSF的裂解液收集細胞。將收集樣本放于4 ℃裂解30 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清。用BCA蛋白檢測試劑盒檢測樣本蛋白濃度，取一定量總蛋白樣本，加入Loading buffer，95 ℃變性5 min。用SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。1抗4 ℃孵育過夜，次日，PBS-T清洗3次，二抗室溫孵育1 h，PBS-T清洗3次，ECL顯影劑顯影，凝膠成像儀記錄成像。

3 結果

3.1 細胞活性檢測 應用MTS法檢測VPA、TSA處理24 h后細胞活性，用酶標儀檢測490 nm處吸光度值，吸光度值與細胞活性呈正比。結果顯示，5、10 mmol/L VPA處理24 h，細胞活性明顯低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，5 μmol/L TSA處理24 h，細胞活性明顯低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，后續實驗選用VPA的濃度為10 mmol/L，TSA的濃度為5 μmol/L。結果見圖1。

3.2 細胞凋亡檢測 用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒染色，檢測VPA、TSA處理24 h后細胞凋亡，用流式細胞儀檢測。結果顯示，10 mmol/L VPA處理24 h或5 μmol/L TSA處理24 h，細胞凋亡率顯著高于空白組，VPA引起細胞凋亡率高于TSA，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見圖2、圖3。

3.3 線粒體膜電位檢測 用JC-1染色，檢測VPA、TSA處理24 h后細胞線粒體膜電位情況，用熒光顯微鏡檢測。結果顯示，10 mmol/L VPA處理24 h或5 μmol/L TSA處理24 h，細胞線粒體膜電位明顯低于空白組，VPA引起線粒體膜電位降低更明顯(P<0.05)。見圖4。

3.4 PI3K/AKT/mTOR通路活性 用免疫印跡的方法檢測VPA、TSA處理24 h后細胞PI3K/AKT/mTOR通路活性。結果顯示，10 mmol/L VPA處理24 h或5 μmol/L TSA處理24 h，細胞PI3K/AKT/mTOR通路活性降低明顯，VPA的抑制作用更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

3.5 凋亡通路檢測 用免疫印跡的方法檢測VPA、TSA處理24 h后細胞凋亡通路情況。結果顯示，10 mmol/L VPA處理24 h或5 μmol/L TSA處理24 h，細胞Bcl-2活性明顯降低，Bax活性明顯升高，cleaved-caspase-3比例明顯升高，VPA的作用更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

3.6 自噬檢測 應用免疫印跡的方法檢測VPA、TSA處理24 h后細胞自噬激活情況。結果顯示，10 mmol/L VPA處理24 h或5 μmol/L TSA處理24 h，細胞LC3Ⅱ表達增加，p62表達明顯降低，VPA的作用更明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖1 VPA和TSA對細胞活性的影響

圖2 VPA和TSA對細胞凋亡的影響

圖3 VPA和TSA對細胞凋亡的影響

圖4 VPA和TSA對線粒體膜電位的影響

圖5 VPA和TSA對細胞PI3K/AKT/mTOR通路活性的影響

圖6 VPA和TSA對細胞凋亡通路的影響

圖7 VPA和TSA對細胞自噬的影響

4 討論

目前，VPA被用于抗癲癇發作活動以及偏頭痛和雙相性精神障礙的治療。雖然VPA的耐受良好，但是其肝毒性嚴重，且機制不明[8]。本研究結果顯示，VPA可以引起人肝細胞系HepG2凋亡，與之前的研究結果相似。

有研究發現，VAP處理肝細胞后AKT1基因表達改變明顯[7]。PI3K/AKT/mTOR通路是調控細胞生存、增殖的重要通路[9]。因此，本研究進一步檢測了VPA處理后PI3K/AKT/mTOR通路的活性。結果顯示，VPA可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性降低。研究提示，VPA引起的AKT改變與線粒體異常有關，線粒體膜通透性障礙和線粒體膜電位消失可以引起線粒體腫脹破裂，而線粒體損傷將觸發Bcl-2/Bax介導的線粒體凋亡通路，從而引起細胞死亡[10]。有研究發現，Bax/Bcl-2是細胞凋亡作用強弱的重要指標，caspase-3是下游重要的誘導細胞凋亡的通路。本研究顯示，VPA除了降低PI3K/AKT/mTOR通路活性，還能進一步破壞線粒體膜電位，提高Bax/Bcl-2及剪切后的caspase-3比例[11]。結果提示，VPA引起的細胞凋亡與線粒體異常緊密相關。PI3K/AKT/mTOR通路是抑制自噬的重要通路，嚴重自噬可以導致細胞凋亡。因此，本研究檢測了自噬的活化程度，結果顯示，10 mmol/L VPA處理24 h或5 μmol/L TSA處理24 h，細胞LC3Ⅱ表達增加，p62表達明顯降低，LC3Ⅱ和p62是衡量自噬潮的重要指標，研究結果表明，VPA和TSA可以引起自噬潮的發生。

此外，本研究進一步探討了VPA引起的PI3K/Akt/mTOR通路活性改變與線粒體異常是否與其HDAC抑制劑活性相關。使用HDAC抑制劑TSA，檢測致死劑量TSA對PI3K/Akt/mTOR通路和線粒體膜電位的影響，結果顯示，雖然TSA可以抑制PI3K/Akt/mTOR通路活性，改變線粒體膜電位，但是作用效果不大。提示VPA的肝毒性與其HDAC抑制劑活性有部分相關。

綜上所述，PI3K/Akt/mTOR通路抑制、線粒體異常引起的凋亡在VPA相關肝毒性中發揮重要作用，而且VPA的肝毒性與其HDAC抑制劑活性具有一定關聯。