衣原體包涵體膜蛋白的結構特征及生物學功能研究進展

衣原體屬家族成員為專性細胞內寄生菌，主要包括原體(Elementary body, EB)和網狀體(Reticulate body, RB)兩種形態。根據16S rRNA和32S rRNA的序列相似性將其分為12個種[1]，其中對人致病的主要有沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, Ct)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci, Cps)及肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae, Cpn)。前者可致盲，是性傳播疾病的主要致病菌，后兩者主要引起呼吸道感染。

在感染細胞內，衣原體在一種被稱為包涵體的膜隔室內進行生物合成和組裝。該膜隔室(包涵體)可為衣原體提供復制微環境，此外衣原體營養物質的獲取也需通過包涵體。感染性EBs進入易感細胞后，一系列由衣原體編碼的蛋白將對包涵體進行修飾以逃逸宿主內吞途徑并在宿主細胞內穩定生存[2]。這是衣原體在細胞內完成復制周期的必要條件。

包涵體膜蛋白(Inclusion membrane protein, Inc蛋白)為衣原體基因編碼的Ⅲ型分泌系統(Type Ⅲ secretory system, T3SS)效應蛋白，經由T3SS轉位并插入包涵體膜后可對包涵體進行廣泛修飾[3]。這些修飾包涵體的蛋白位于宿主-衣原體相互作用界面，可作為分子橋梁介導宿主與衣原體的相互作用，因而必定在衣原體的致病機制中發揮重要作用。近年來，Inc蛋白一直是衣原體研究領域的重點，因此，本文對Inc蛋白的研究進展進行了綜述。

1 包涵體膜蛋白的結構特征

Inc蛋白的發現最初源于Rockey等[4]對細胞內發育階段中特有衣原體蛋白的探究。其使用康復期感染動物的抗血清對Cps DNA進行了篩選，結果表明存在一種蛋白產物(被命名為IncA)定位于包涵體膜。隨后在Ct中用同樣的方法鑒定出了IncA[5]。Scidmore-Carlson等[6]使用免疫血清檢測衣原體的表達文庫，成功識別了IncD、IncE、IncF、IncG這4種新的Inc蛋白。其次，在T3SS的研究[7]及宿主細胞胞質免疫蛋白酶體加工[8]中也鑒定出了Inc蛋白。

Inc蛋白對包涵體的廣泛修飾可使包涵體避免與內吞囊泡融合而逃逸宿主內吞。不同Inc蛋白的一級結構存在較大的差異，但Bannantine等[9]對當時已證實為Inc蛋白的Ct和Cpn IncA及Cps IncA、IncB、IncC的氨基酸序列進行了疏水性分析，結果表明這些Inc蛋白的疏水性圖譜中均含有一個大約為50個氨基酸的雙葉疏水結構域。并應用血清學方法進一步證實了其它幾種含有該結構域的蛋白也定位于包涵體膜。隨后，Toh等[10]應用該特征性結構域分別預測了90種Cpn假定Inc蛋白和36種Ct假定Inc蛋白。其中部分假定Inc蛋白也在隨后的研究中被證實存在于包涵體膜上[11-12]。2011年，Dehoux等[13]應用異源分泌系統證實90%的Ct和Cpn假定Inc蛋白的N末端為功能性TTS信號。并應用生物信息學方法對假定Inc蛋白進行分析，結果表明Inc蛋白的雙葉疏水結構域由兩個大約含有15～32個氨基酸殘基的跨膜 α 螺旋構成，并且這兩個跨膜結構域被一個短鏈環連接(3～22個殘基)。此外，在一些Inc蛋白中也發現存在有一個由大約180個氨基酸組成的ADP核糖結合結構域，即A1pp結構域。由于存在該結構域，細菌可將NAD+代謝物或ADP-核糖基化蛋白募集至包涵體膜，進而完成各種生物學功能。還有一些Inc蛋白中存在卷曲螺旋結構(如IncA)，該結構可能在Inc蛋白與宿主蛋白的相互作用中發揮了重要功能。

Inc蛋白可通過特征性雙葉疏水結構域插入包涵體膜，且這些蛋白的兩個末端(N末端和C末端)朝向胞質，其中大部分Inc蛋白的N末端含有可介導Inc蛋白轉位至包涵體膜的TTS信號[13]，而多數研究均顯示C末端內含有與宿主細胞相互作用的特異性結構域[14-20]，如IncA的可溶性NSF附著蛋白受體(Soluble NSF attachment protein receptor, SNAREs)樣基序、IncV的FFAT樣基序及Cpn0585的Rab GTPase結合蛋白結構域。因而，衣原體可通過Inc蛋白與宿主的相互作用來調節自身在宿主細胞內的生存。

2 包涵體膜蛋白的生物學功能

特征性的雙葉疏水結構域使Inc蛋白能夠插入包涵體膜，并且朝向胞質的Inc蛋白C末端可與宿主蛋白相互作用，從而在衣原體營養攝取、細胞內生存及子代原體的釋放等多個方面發揮重要作用(圖2)。

2.1控制宿主細胞的囊泡轉運途徑 為了建立和維持利于自身生存和復制的微環境，衣原體可利用多種宿主細胞過程，其中包括囊泡轉運途徑。囊泡轉運途徑是細胞內膜包裹細胞器之間物質轉運的主要方式。Rab GTPases為囊泡轉運途徑的主要調節器，在物質的囊泡轉運中發揮重要作用[21]。已有研究表明，衣原體可將多種Rab GTPases募集至包涵體，包括Rab4/11/14(內吞途徑)[22]、Rab1/6/10(ER-Golgi相關途徑)[22]和Rab39[23]。Inc蛋白在這些Rab GTPases的募集中發揮了重要作用，其中Ct Inc蛋白CT229為Rab4的相互作用蛋白，可將Rab4募集至包涵體[24]，而Cpn Cpn0585可募集多種Rab蛋白至包涵體，包括Rab1、10和11[14]。在某些情況下，Rab結合蛋白也能被直接募集至包涵體膜，如BICD1(Rab6相互作用蛋白)能以不依賴Rab6的方式被募集至包涵體，表明Inc蛋白能直接募集BICD1[25]。通過募集這些Rab GTPases及其相互作用蛋白，衣原體可利用囊泡轉運途徑獲取自身所需的營養物質及進行囊泡轉運[26]。除能募集Rab GTPases外，衣原體還能將宿主SNAREs蛋白募集至包涵體[25]。SNAREs蛋白是細胞內膜融合機制的關鍵組分，囊泡內的t-SNAREs可與靶細胞器內的v-SNAREs形成四聚體螺旋結構促進膜的融合[27]。衣原體中多種Inc蛋白含有SNAREs樣基序，包括IncA、CT813和CT223[28]。其中IncA可促進包涵體的同型融合[19, 27-29]，并且介導包涵體同型融合的功能核心區即為SNARE樣結構域[30]。但是，在包涵體與內 吞囊泡的相互作用中，IncA卻能抑制包涵體膜與宿主內吞囊泡的融合[27]。此外，衣原體IncE可結合分選成分SNX5和SNX6，并募集這些逆向轉運復合物成分至包涵體，以控制宿主的逆向囊泡轉運途徑[16, 31-33]。逆向囊泡轉運復合物介導的過程參與了許多基礎細胞過程，如溶酶體的生物合成、營養物質的獲取及細胞信號的傳導，因此，衣原體對逆向轉運途徑的操縱有利于衣原體的生存。包涵體也能以微管或動力蛋白依賴性方式被轉運至高爾基體附近或微管組織中心(microtubule organizing center, MTOC)定位。Cps IncB[34]和Ct包涵體膜上特定微區域內的Inc蛋白(包括IncB、IncC、CT101、CT222、CT223、CT224、CT228和CT850[12])可參與該過程。其中IncB可將可溶性NSF附著蛋白相關蛋白(Soluble NSF attachment protein associated protein; Snapin)募集至Cps的包涵體膜上，包涵體膜上的Snapin蛋白與動力蛋白相互作用可介導包涵體沿微管網運動。而微區域存在Inc蛋白可募集活性Src家族激酶[35]。該激酶可促進微管成核及包涵體的動力蛋白依賴性運動，從而介導包涵體的細胞內運動。隨后，Mital等[36]又進一步發現CT850可與動力蛋白輕鏈1(Dynein light chain Tctex-type 1, DYNLT1)發生相互作用，通過募集這些DYNLT1蛋白，包涵體在宿主細胞內的運動可被促進。

左圖為Inc蛋白的模式圖。右圖中紅色圓圈內即為氨基酸序列中雙葉疏水結構域所在的部位。其中(a)～(f) 分別代表Ct IncA (CT119)、IncB (CT232)、IncC (CT233) 和Cpn IncA (Cpn0186)、IncB (Cpn0291)、IncC (Cpn0292)圖1 Inc蛋白的特征性結構Fig.1 Characteristic structure of inclusion membrne proteins (Inc proteins)

圖2 Inc蛋白的生物學功能Fig.2 Biological function of Inc proteins

2.2在非囊泡轉運中的作用 除了靶向小GTPases、SNAREs和逆向囊泡轉運復合物操縱宿主細胞器間的囊泡轉運外，衣原體包涵體也可與宿主細胞器膜形成膜接觸位點(Membrane contact sites, MCS)以應用宿主細胞的非囊泡轉運途徑。MCS是兩個細胞器膜緊密接觸的距離在10～30 nm之間的部位，其可介導細胞器間脂質和Ca2+的非囊泡轉運[37]。衣原體包涵體可與內質網形成MCS，Inc蛋白在MCS中既可發揮結構性作用穩定MCS，也能發揮功能性作用將功能性成分募集至MCS。

Stanhope等[15]證實IncV(CT005)可發揮結構性作用介導MCS的形成，其中IncV所含有的FFAT樣基序可與內質網駐留蛋白VAPs相互作用介導內質網-包涵體MCS形成。但IncV并不是介導MCS形成的唯一分子，還存在其它Inc蛋白也能在MCS的形成中發揮作用，因為IncV的缺失只能使MCS范圍縮小，而不能使MCS形成缺失。

Inc蛋白除能介導MCS形成外，還能將功能性成分募集至MCS處發揮作用。有研究顯示，IncD能將神經酰胺轉運蛋白(ceramide transfer protein, CERT)募集至MCS處[38-39]。CERT為一種功能性成分，其可參與內質網-高爾基體MCS處鞘磷脂前體神經酰胺的非囊泡轉運[40]。因此Isabelle等[38]猜測被募集到內質網-包涵體膜接觸位點處的CERT也能作為功能性成分將神經酰胺從內質網轉運至包涵體，轉運至包涵體的神經酰胺能在包涵體內被進一步修飾成為鞘磷脂(其為衣原體復制所必需的脂質)，從而維持衣原體的正常發育周期。除CERT外，Ca2+感受器基質相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1, STIM1)也能被募集至內質網-包涵體MCS，并與CERT和VAPs共定位[41]。但內質網-質膜MCSs處的STIM1相互作用蛋白Orail并不定位于包涵體膜，表明可能存在Inc蛋白可模擬Orail將STIM1募集至包涵體，從而發揮相應生物學功能。

2.3維持宿主細胞存活 衣原體為專性細胞內寄生菌，其必須在宿主細胞內存活足夠長的時間才能完成其發育周期。因此，衣原體進化出了一系列可避免宿主細胞死亡的機制，如衣原體感染可引起細胞凋亡抑制蛋白2(c-IAP2)穩定并能使促存活因子Mcl-1上調[42-43]。其次，Inc蛋白在維持宿主細胞存活中也發揮了重要作用。Ct Inc蛋白CT118(IncG)可與宿主14-3-3β蛋白發生相互作用并將其募集到包涵體膜上[44]。包涵體膜上的14-3-3β蛋白可與Raf-1、磷酸化Bad發生相互作用抑制宿主細胞凋亡，從而維持宿主細胞的存活。此外，Cpn Inc蛋白Cpn1027可將Wnt信號通路調節因子胞質活化/增殖相關蛋白2(Caprin2)及β-catenin降解復合物組分糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK3β)募集至包涵體[18]。這種相互作用可封閉β-catenin降解復合物，從而使胞質內的β-catenin累積。累積的β-catenin進而可激活多種Wnt靶基因以促進衣原體的抗凋亡活性。Ct Inc蛋白CpoS(CT229)可對抗STING介導的促細胞死亡作用和IFN-I型反應[45]。CopS的失活可誘導感染細胞快速凋亡和壞死。并且CpoS缺陷型衣原體可誘導由cGAS/STING/TBK1/IRF3信號通路所介導的強烈IFN-I型反應，從而引起細胞死亡。Weber等[46]也證實Ct的某些Inc蛋白是包涵體關鍵的結構性成分，對維持液泡的完整性至關重要。特異性Inc蛋白的缺失使包涵體膜易破裂，從而將細菌釋放入細胞質，宿主細胞感知到細菌存在時就會啟動凋亡途徑，并最終導致宿主.細胞死亡。

2.4對宿主免疫應答的影響 衣原體可引起宿主細胞產生一系列反應以清除入侵的宿主病原體，同時，衣原體也進化出了一系列機制以逃逸宿主免疫應答。有研究表明Cpn的Inc蛋白CP0236可與宿主NF-κB激活劑1(Act1)蛋白相互作用并將其封存于包涵體膜上[47]。Act1蛋白為IL-17介導的信號通路的關鍵組分，其可激活下游的NF-κB因子，從而激活NF-κB信號通路，引起宿主免疫應答。當Act1蛋白被封存在包涵體膜上時，NF-κB的激活受阻，IL-17所介導的信號通路受損，從而引起宿主固有免疫和適應性免疫應答受抑制，該過程有助于衣原體在機體內生存復制。然而，Ct Inc蛋白Cap1(CT529)[48]和CrpA(CT442)[8]卻有助于感染小鼠體內衣原體的清除。這兩種Inc蛋白均為CD8+T細胞的靶蛋白，可經MHCⅠ類分子提呈給CD8+T細胞，從而激活機體的適應性免疫應答清除機體內衣原體。此外，這兩者還能引起機體產生保護性免疫，將前者誘導產生的特異性T細胞注入小鼠體內可對感染小鼠產生極強的保護作用[48]，后者的重組蛋白經免疫接種后可使機體產生一定的保護性免疫[8]。

2.5調節子代原體的釋放 在衣原體發育周期末，子代原體需從宿主細胞內釋放以繼續下一個感染周期。其中子代原體的釋放主要涉及兩個機制：細胞裂解和擠壓釋放[49]。細胞裂解涉及半胱氨酸蛋白水解酶類對包涵體膜和質膜的水解。而子代原體的擠壓釋放類似于胞吐過程，釋放過程需要肌動蛋白、肌球蛋白和Rho家族GTP酶RhoA[49]。Lutter等[50]研究表明Ct Inc蛋白CT228可以通過將肌球蛋白磷酸酶復合物中的肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1)募集至包涵體膜微區域，從而調節EBs的擠壓釋放過程，但其并未闡述調節肌球蛋白磷酸酶活性的具體機制。隨后Nguyen等[51]的研究闡明了肌球蛋白磷酸酶活性的調節機制。其表明Ct Inc蛋白MrcA(CT101)可與Ca2+通道1,4,5-三磷酸肌醇3型受體(inositol-1,4,5-trisphosphate receptor, type 3, ITPR3)相互作用，并將ITPR3募集至包涵體上富含活性Src家族激酶的微區域上。MrcA的缺失和ITPR3的抑制均可使衣原體擠壓釋放嚴重受損。此外，Ca2+通道ITPR3還可與Ca2+感受器STIM1作用調節儲庫中Ca2+的釋放，使胞質內Ca2+濃度增加。Ca2+濃度的增加在促進肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain2, MLC2)磷酸化的同時，也能激活Rho激酶(Rho-associated kinase, ROCK)，進而使MYPT1磷酸化(肌球蛋白磷酸酶活性下降)，從而維持肌球蛋白的動力活性以利于子代衣原體的擠壓釋放。

3 展 望

目前，對部分Inc蛋白在衣原體生長發育中的作用已經有了一定的認識，如Ct IncA可促進包涵體同型融合、IncD有利于衣原體所需脂質-鞘磷脂的獲取、CT229及IncC等Inc蛋白可維持衣原體包涵體的穩定性、CT228及CT101等蛋白可調節衣原體子代的釋放。但仍未完全清楚這些蛋白發揮生物學功能的具體機制，且在衣原體蛋白家族中仍然有許多假定的Inc蛋白未被實驗驗證，在已被證實定位于包涵體膜上的Inc蛋白中，仍然有絕大多數蛋白的生物學功能尚未被揭示。Inc蛋白在衣原體整個發育周期中具有重要的作用，其不僅能介導衣原體所需營養物質的獲取，也能抑制宿主細胞死亡，但存在一些Inc蛋白可能有利于衣原體的細胞內清除。因此，接下來應加強對Inc蛋白的研究，深入探究Inc蛋白在衣原體致病中的作用及探索除Cap1和Crap外是否存在其它可介導保護性免疫產生的Inc蛋白，從而為揭示衣原體致病機制及研發衣原體疫苗提供理論依據。

利益沖突：無

本文引用格式：肖健, 王川, 吳移謀. 衣原體包涵體膜蛋白的結構特征及生物學功能研究進展[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4):338-344. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.033