Caspase-3在黃鱔性腺性逆轉過程中的表達及定位分析

何 智，何治德，2，何 亮，阮會斌，李 松，嚴太明

(1.四川農業大學動物科技學院，成都 611130；2.瀘州市農業農村局，四川 瀘州 646000)

半胱氨酸蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)是Caspase家族中最重要的凋亡執行者[1]，活化后直接參與切割細胞多種結構蛋白和功能蛋白，引起細胞以凋亡的形式解體[2，3]。哺乳動物Caspase-3參與了濾泡細胞凋亡過程[4]，在凋亡中晚期表達量明顯升高[5，6]。同樣，魚類卵母細胞凋亡過程也需要Caspase-3的參與[7]。三斑海豬魚(Halichoerestrimaculatus)由雌性向雄性轉變期卵母細胞中檢測到Caspase-3的大量表達[8]。熱應激誘導銀漢魚(AtherinableekeriGünther)卵母細胞凋亡過程中，Caspase-3活性與卵母細胞的凋亡具有明顯的同步性[9]。

黃鱔(Monopterusalbus)隸屬于合鰓魚目(Synbgranchiformes)合鰓魚科(Synbranchidae)黃鱔屬(Monopterus)[10]，存在由雌性性腺向雄性性腺轉變的天然性逆轉現象。研究證實黃鱔性逆轉過程伴隨著性腺的凋亡[11]，但其凋亡具體機制目前尚不清楚。本研究通過克隆caspase-3的序列，檢測其mRNA表達水平和蛋白相對含量的變化，并定位其在不同發育時期的卵母細胞的表達位置，探究Caspase-3與黃鱔性逆轉的相關性，期望為揭示黃鱔性逆轉機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用黃鱔購自于四川省成都市溫江區瑞航農貿市場，分別于2017年1月—12月每月取樣1次，每次取樣60尾左右。挑選體質健康、不同規格的黃鱔于四川農業大學水產養殖系實驗室暫養24 h后，進行不同發育時期性腺樣本的收集。性腺組織一部分使用包恩氏液固定，用于發育時期鑒定和免疫組化定位；另一部分液氮速凍后，-80 ℃保存備用。

1.2 性腺發育時期鑒定和樣本篩選

參照肖亞梅的報道[13-14]，采用石蠟組織切片進行性腺發育時期的鑒定，從采集的樣本中挑選卵黃生成中期、間性早期、間性中期、間性晚期和雄性時期的性腺樣本用于本實驗。

1.3 總RNA提取與cDNA第一鏈合成

使用Invitrogen公司的Trizol Reagent進行總RNA提取，cDNA第一鏈合成使用Thermo公司revertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行。

1.4 caspase-3基因中間片段的克隆和序列分析

根據已報道的大黃魚(Larimichthyscrocea)、鱖(Sinipercachuatsi)、黑班小丑魚(Amphiprionmelanopus)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、大西洋鮭(Salmosalar)、斑馬魚(Daniorerio)和唐魚(Tanichthysalbonubes)等魚類的caspase-3基因序列設計簡并引物：F：5′-AACAACAAGAACTTTGA-3′與R：5′-ABGCRTAGAGGAAGTC-3′，引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。反應體系：cDNA 模板l.0 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，2×Mix(0.1 U/μL)10.0 μL，H2O 8.2 μL。PCR反應條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，90 s，35個循環；72 ℃，30 min；12 ℃，forever。PCR結束后取4 μL產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。將目的產物送往成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

用BlastX、SeqMan軟件將測序結果與其他物種比對，DNAMAN軟件預測編碼氨基酸序列，MEGA 5.0軟件進行同源氨基酸序列比對，采用鄰位連接法(Neighbor-joining method)構建系統進化樹(Bootstraps=1 000)。

1.5 不同發育時期性腺caspase-3表達分析

使用獲得的基因序列片段，以及黃鱔elongation factor-1-α(ef1α)和ribosomal protein L17(rpl17)作為內參基因，設計定量檢測引物(表1)。采用雙標準曲線法計算基因的相對表達量[15]。數據統計采用SPSS19.0統計分析軟件Tukey法進行多重比較，數據的表示方法為平均值±標準誤(Mean±SEM)，顯著性水平為0.05，每個數據均來自5個生物學重復。

表1 黃鱔caspase-3基因定量分析引物

1.6 Caspase-3相對含量測定

將-80 ℃保存的性腺組織樣本融化后保持在2～8 ℃，加入一定量的磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)后用勻漿器充分勻漿。3 000 r/min，離心2 min，收集上清備用。

樣品中蛋白含量測定采用上海酶聯生物科技有限公司提供的魚半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒進行。同時，用牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白標準品，采用BCA總蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中可溶性總蛋白含量。樣品中Caspase-3蛋白的相對含量為單位體積勻漿液中酶含量和可溶性總蛋白含量的比值。

1.7 Caspase-3免疫組化定位

Caspase-3抗血清選用抗原與黃鱔肽段具有較高的同源性兔抗血清，購買于艾博抗(上海)貿易有限公司(Abcam公司產品，編號為ab13847)。

石蠟切片經脫蠟至水化，用新配置的3% H2O2室溫(24 ℃)孵育20 min，以去除內源性過氧化物酶，PBS(pH7.4)浸洗3次(3 min/次)；0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)95 ℃加熱，并持續15 min，進行抗原修復，PBS浸洗3次(3 min/次)。正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min；滴加第一抗體(PBS 500倍稀釋)，37 ℃放置2 h，PBS浸洗3次(3 min/次)，滴加第二抗體(羊抗兔IgG，武漢博士德公司產品，PBS 1 000倍稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBS浸洗3次(3 min/次)；DAB(武漢博士德公司產品)顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。陰性對照用PBS代替第一抗體。

2 結果

2.1 Caspase-3生物信息學分析

獲得黃鱔caspase-3核苷酸序列長度為432 bp，編碼氨基酸144個。基于NJ法構建Caspase-3氨基酸序列系統進化樹結果顯示，黃鱔與大黃魚(L.crocea)和鱖(S.chuatsi)等聚為一支，親緣關系較近(圖1)。

圖1 黃鱔和其它物種Caspase-3的NJ系統進化分析

2.2 Caspase-3在不同發育時期黃鱔性腺中的表達分析

黃鱔caspase-3 mRNA在雌性性腺向雄性性腺發育的過程中均有表達，隨著雌性性腺向雄性性腺的發育表達量呈下降的趨勢，并表現出明顯的雌雄差異(P<0.05)。其中，卵黃生成中期、間性早期和間性中期性腺的表達量差異不顯著，但高于間性晚期和雄性性腺(圖2)。

圖2 黃鱔caspase-3 mRNA在不同發育時期性腺中的表達分析

2.3 黃鱔不同發育時期性腺中Caspase-3相對含量

Caspase-3相對含量與黃鱔性腺性逆轉過程關系密切。在性逆轉過程中Caspase-3相對含量呈上升的趨勢，在間性晚期達到極大值(圖3)。

圖3 黃鱔Caspase-3在不同發育時期性腺中的相對含量

2.4 不同發育時期黃鱔性腺中Caspase-3定位分析

Caspase-3在黃鱔各發育時期性腺中的定位結果見圖4。在卵黃生成期黃鱔性腺中，Caspase-3主要分布在卵黃積累期卵母細胞細胞質，初級生長期卵母細胞的細胞質和細胞核(圖4A，a)。間性早期和間性中期黃鱔性腺中，Caspase-3信號主要分布皮質小泡期卵母細胞的細胞核和顆粒細胞、初級生長期卵母細胞的細胞質和細胞核(圖4B，b；圖4C，c)。在間性晚期黃鱔性腺中，Caspase-3信號主要分布在初級生長期卵母細胞的細胞質和細胞核(圖4D，d)。在陰性對照中未觀察到Caspase-3明顯的陽性信號(圖4E)。

圖4 黃鱔Caspase-3在不同發育時期性腺中的定位

3 討論

已有資料表明，哺乳動物生殖細胞在發生過程中的大量死亡或丟失是屬于細胞凋亡，這一過程與Caspase-3等Caspases家族蛋白的表達調控密切相關[16]。小鼠和牛卵巢中卵泡閉鎖時，Caspase-3的表達能導致凋亡細胞基因組DNA的特異性降解[17]，猴和綿羊卵母細胞凋亡程度與Caspase-3活性呈正相關[6，18]，在人卵巢顆粒細胞中凋亡過程中也存在類似的現象[18]。同樣，Caspase-3在魚類卵母細胞的凋亡過程中也扮演了重要角色[20，21]。三斑海豬魚性腺由雌性向雄性變化過程中，卵母細胞凋亡與Caspase-3蛋白表達關系密切[8]。熱應激條件下，銀漢魚卵母細胞凋亡與Caspase-3大量表達有關[9]。黃鱔Caspase-3在不同發育時期性腺中均有表達且與性逆轉具有明顯的同步性，這表明Caspase-3參與了黃鱔性腺性逆轉過程，并和性腺中卵母細胞的凋亡關系密切。

Caspase-3作為細胞凋亡通路中非常關鍵的效應分子，在細胞未發生凋亡時，以無活性的酶原形式存在，而當細胞發生凋亡時，Caspase-3被活化[22]。綿羊卵母細胞受到凋亡促進作用時，Caspase-3活性顯著升高[18]。猴和小鼠卵母細胞凋亡晚期的Caspase-3活性顯著高于凋亡早期[5-6]。本研究中，caspase-3表達水平在卵黃生成期最高，在性逆轉過程中的間性晚期最低。但Caspase-3相對含量則呈現相反的表達趨勢,隨著性逆轉的發生，其相對表達量呈上升的趨勢，表現出與性逆轉的高度同步性，并在間性晚期達到極大值。由此推測，在黃鱔性逆轉開始前就已有大量的Caspase-3酶原儲備，隨著性逆轉開始，大量的酶原活化，并參與黃鱔卵母細胞的凋亡。

在人胎兒卵巢組織中，Caspase-3陽性信號在卵細胞內均有表達，主要定位于卵細胞的細胞質，少量表達于細胞核。此外，胎兒卵巢內的顆粒細胞也具有陽性信號，且其表達在孕中期及孕晚期均為強陽性[23]。Caspase-3在新生大鼠卵母細胞細胞核及其周圍表達，在顆粒細胞中也能檢測到陽性信號，而卵母細胞形成原始卵泡和初級卵泡的過程均未檢測到陽性信號[24]。這些結果表明，Caspase-3在卵母細胞凋亡中扮演了重要角色。同樣，在鈍齒巨兔脂鯉(Leporinusobtusidens)濾泡閉鎖晚期的濾泡細胞和膜細胞能檢測到大量的Caspase-3陽性信號，而在閉鎖早期信號較弱[7]。使用Caspase-3免疫組織化學染色法檢測性逆轉前后三斑海豬魚卵母細胞凋亡發現，在雌性性腺的卵母細胞中未檢測到明顯的凋亡信號，但在性逆轉早期的卵母細胞的細胞質和細胞核中均檢測到陽性信號[8]。本研究中，從間性早期到間性晚期性腺中初級生長期卵母細胞細胞質均有陽性信號，表明初級生長期卵母細胞凋亡貫穿性逆轉始終；間性早期和間性中期的皮質小泡期卵母細胞細胞核中有陽性信號，推測皮質小泡期卵母細胞凋亡主要發生在性逆轉早期；卵黃生成期卵母細胞陽性信號位于細胞質，主要在卵黃生成中期和間性早期發生凋亡。Caspase-3陽性信號在皮質小泡期卵母細胞細胞核和顆粒細胞，而在細胞質中未見明顯信號，這可能是由于皮質小泡期卵母細胞細胞質中迅速沉積和充塞的大量脂滴和卵黃物質使得細胞質中陽性信號變得不明顯。此外，各個性腺發育時期的初級生長期卵母細胞的細胞質和細胞核均有表達，而在其濾泡細胞中未檢測到明顯的陽性信號，這可能和其濾泡細胞并未開始大量增殖和分化為顆粒細胞有關。劉修業等[25]研究結果也證實，幼小的卵母細胞退化方式與體積大的卵母細胞有所不同，退化完成的時間比體積大的卵母細胞要晚。而在本實驗中，性逆轉過程中首先消失的是體積較大的卵母細胞的信號，最后才是初級生長期卵母細胞消失，卵母細胞凋亡完成的時序與劉修業描述的卵母細胞凋亡順序一致。黃鱔Caspase-3的這種表達模式與其它物種存在較大的差異，這可能與黃鱔為分批產卵方式和產卵后進入性腺性逆轉過程的特性有密切關系。