PCR檢測痰曲霉菌在慢性阻塞性肺疾病合并侵襲性肺曲霉菌病中的診斷價值

王 琴， 嚴夢楠， 宋一祎， 李華茵

復旦大學附屬中山醫院呼吸內科，上海 200032

侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是嚴重的機會性感染性疾病，多見于免疫抑制宿主，如血液系統惡性腫瘤、器官移植患者。盡管廣譜抗真菌藥物不斷發展，IPA患者死亡率還是居高不下[1]。近年來，非粒細胞缺乏患者中IPA的報道越來越多，如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者[2-3]。Guinea等[4]發現，約1.63%的住院COPD患者下呼吸道分泌物中可分離出曲霉菌，其中約22.1%擬診IPA。COPD住院患者繼發IPA多與系統性應用糖皮質激素、廣譜抗生素及機械通氣相關。

2007年，Bulpa等[3]提出COPD患者IPA的診斷標準，分為確診、擬診、疑診和定植。其中，確診有賴于組織病理學檢查；擬診患者要求臨床依據(COPD患者近期因急性加重住院，胸部影像學提示曲霉菌感染，對常規抗感染治療無反應)和病原學依據[下呼吸道分泌物分離出曲霉菌或者連續2次血清半乳甘露聚糖(GM)實驗陽性]；疑診患者缺乏病原微生物依據；定植為患者缺乏臨床表現但下呼吸道分泌物分離出曲霉菌。2016年美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America, IDSA)更新了曲霉菌病診治指南，強調分子生物學技術的診斷價值[5]。

大部分COPD住院患者因肺功能差、喘息、機械通氣等原因，不能耐受氣管鏡、經皮肺活檢等有創性檢查，確診IPA困難。常規的痰液培養方法耗時長、陽性率低，不能為快速診斷提供幫助。而分子生物學技術，如熒光定量PCR，具有靈敏度高、特異性強、快速檢測的特點，可為臨床快速診斷提供重要幫助。因此，本研究采用前瞻性觀察性研究，通過收集住院COPD患者的痰液，多重熒光定量PCR檢測方法檢測其中的曲霉菌，探索PCR檢測痰液曲霉菌在COPD患者合并IPA中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選標準：入選2015年4月至2017年3月因COPD急性加重入住復旦大學附屬中山醫院的患者，其均有常規痰液真菌培養標本。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審批(批件號碼：B2016-104)。由于收集患者常規痰曲霉菌培養剩余的痰液為無創傷性，故免簽署患者知情同意書。排除標準：COPD僅作為次要診斷的住院患者。收集患者的一般資料，真菌感染危險因素(糖皮質激素使用情況、廣譜抗生素使用情況、機械通氣等)，臨床癥狀，影像學表現，病原學檢查結果，血清半乳甘露聚糖(GM)實驗結果，血清1,3-β-D葡聚糖(G)實驗結果。

1.2 PCR法檢測痰液曲霉菌 收集患者常規痰真菌培養后剩余痰液，放置于無菌痰杯中，進行DNA提取及多重熒光定量PCR檢測。檢測步驟按照試劑盒說明書(翔瓊生物)進行。

1.2.1 DNA抽提 取200 μL痰液，置于1.5 mL離心管，加入5倍體積的試劑A，振蕩30 s，室溫放置20 min；12 000 r/min(r=6 cm)離心5 min，棄上清，沉淀用1 000 μL 試劑B充分懸浮，12 000 r/min(r=6 cm)，離心5 min，小心棄除上清，留沉淀；沉淀加25 μL試劑C和25 μL試劑D，充分懸浮，振蕩15 s；將離心管置于水浴鍋，37℃，60 min；離心管置于水浴鍋，80℃，15 min；取出離心管，6 000 r/min(r=6 cm)，離心5 min；取1 μL上清作為PCR模板。

1.2.2 PCR反應 配制20 μL PCR反應體系：2×Taqman酶反應液10 μL，3.3×煙曲霉檢測反應液6 μL，DNA模板或陰(陽)性對照品1 μL，無菌水3 μL。將反應液混勻，2 000 r/min(r=6 cm)離心15 s，使所加試劑聚集到管底；PCR擴增。將PCR反應板放入熒光定量PCR儀器中，反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環。信號收集：第2階段60℃時收集熒光基團FAM，參比熒光為ROX。

1.2.3 結果質控 陰性對照的Ct值均應等于40；陽性對照的Ct值應小于或等于35，并有較好的對數增長曲線。否則，視為此次實驗無效。結果判讀：被檢樣品的Ct值小于35并有對數增長曲線為陽性結果；被檢樣品的Ct值等于35時，有對數生長曲線為陽性，無對數生長曲線為陰性結果；被檢樣品的Ct值大于35時，無對數生長曲線為陰性，有較好的對數生長曲線時加大樣本量重做，重做結果同前，則判為陽性，否則為陰性。

1.3 診斷標準 參照2008年歐洲癌癥研究和治療組織(European Organization for Research and Treatment of Cancer, EORTC)/真菌病研究組(Mycoses Study Group, MSG；EORTC/MSG)和2016年IDSA曲霉病診斷臨床實踐指南，將曲霉菌病分為確診、擬診和疑診。確診需要組織病理學依據或正常無菌部位標本曲霉菌培養陽性；擬診患者需符合1項宿主因素、1項臨床依據和1項微生物學標準；疑診患者須符合1項宿主因素和1項臨床依據，而缺乏生物學標準。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，符合正態性和方差齊性的計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 一般資料 49例COPD患者中，18例診斷為IPA，其中確診4例、臨床診斷(擬診+疑診)14例。合并IPA的COPD組患者系統應用糖皮質激素和廣譜抗生素比例高于不合并組(表1)。

2.2 臨床特征對比 結果(表2)表明：與不合并IPA組患者相比，合并IPA組COPD患者發熱更常見；兩組呼吸系統癥狀差異無統計學意義。合并IPA組患者胸部CT結節、空洞更多見，不合并IPA組患者胸部CT多無特殊陽性發現。

表1 COPD住院患者的一般資料

表2 兩組患者臨床特征的對比

2.3 病原學檢查結果

2.3.1 G和GM檢測 18例合并IPA的COPD患者中，15例患者進行了血清G實驗，其中陽性2例、陰性13例；31例不合并IPA的COPD患者中，18例檢測了血清G實驗，陽性8例、陰性10例。血清G實驗對于COPD患者IPA診斷的敏感性和特異性分別為13.3%(95%CI 2.3～41.6)、55.5%(95%CI 31.3～77.5)，陽性預測值和陰性預測值分別為20%(95%CI 3.5～55.7)、43.4%(95%CI 23.8～65.1)。49例患者中僅7例患者進行了血清GM實驗，病例數太少，未進一步計算GM實驗對COPD患者IPA診斷的敏感性及特異性。

2.3.2 痰曲霉菌培養 49例患者均進行了痰液曲霉菌培養檢測。18例合并IPA的COPD患者中，陽性6例、陰性12例。31例不合并IPA的COPD患者中，陽性2例、陰性29例。痰液真菌培養診斷COPD患者IPA的敏感性及特異性分別為33.3%(95%CI 14.3～58.8)和93.5%(95%CI 77.1～98.8)，陽性預測值和陰性預測值分別為75%(95%CI 35.5～95.5)和70.7%(95%CI 54.2～83.3)。

2.3.3 熒光定量PCR檢測痰曲霉菌 49例患者均進行痰液熒光定量PCR以檢測曲霉菌。18例合并IPA的COPD患者中，陽性13例、陰性5例。31例不合并IPA的COPD患者中，陽性4例、陰性27例。熒光定量PCR檢測痰液中曲霉菌診斷COPD患者合并IPA的敏感性及特異性分別為72.2%(95%CI 46.4～89.2)和87.1%(95%CI 69.2～95.7)，陽性預測值和陰性預測值分別為76.5%(95%CI 49.8～92.2)和84.4%(95%CI 66.4～94.1)。

3 討 論

COPD患者IPA的發生率報道并不一致，為1%～9%[4,6-7]。全身應用糖皮質激素在住院COPD患者發生IPA中有促進作用。研究[5]發現，應用強的松日劑量大于20 mg或累計劑量大于700 mg的患者IPA的風險顯著增加；亦有研究[8]發現，長期吸入糖皮質激素增加COPD患者IPA的風險。本研究得出類似結論，在合并IPA的COPD患者中，88.9%的患者全身應用糖皮質激素；而在不合并IPA的COPD患者，僅25.8%的患者全身應用糖皮質激素。吸入糖皮質激素在兩組間差異無統計學意義。其他有意義的危險因素還包括廣譜抗生素的應用。而合并其他基礎疾病如糖尿病、心血管疾病、低蛋白血癥等在兩組間差異無統計學意義。與不合并IPA的COPD患者相比，合并IPA的COPD患者臨床特征以發熱更常見，胸部CT以多發結節伴空洞更多見，而既往研究[3]結果提示其以浸潤實變影多見，可能與本研究樣本量小有關。

COPD患者合并IPA的診斷率低，組織病理學是目前最可靠的診斷方法。但因住院COPD患者肺功能差，氣急明顯，難以耐受氣管鏡及肺穿刺等有創檢查，從而導致確診率低，多依賴于臨床診斷。本研究中18例診斷為IPA的患者中，僅4例患者接受了氣管鏡檢查，得到臨床確診，其余14例均為臨床診斷。病原微生物學依據在COPD患者IPA的診斷中具有至關重要的價值。1,3-β-D葡聚糖是大部分真菌細胞壁組成成分(接合菌、隱球菌除外)，故其陽性并不代表一定為曲霉菌感染。G實驗在診斷真菌感染中的敏感性和特異性分別為77%、85%[9]。本研究中18例患者檢測了血清G實驗，陽性8例、陰性10例。血清G實驗對于COPD患者IPA診斷的敏感性和特異性分別為13.3%、55.5%，顯著較低，可能與病例數較少、采樣時間及多數患者經驗性應用抗真菌藥物有關。半乳甘露聚糖是曲霉菌細胞壁上的多聚抗原，與G實驗相比，GM實驗對曲霉菌病的診斷有較高的特異性。文獻[10]報道，GM實驗的敏感性和特異性分別為61%～89%和84%～95%。COPD患者肺泡灌洗液中GM實驗的診斷價值與粒細胞缺乏患者血清GM實驗的診斷價值相似。但本研究僅7例患者進行了GM實驗，故未予進一步探討GM實驗的診斷價值。

痰液曲霉菌培養簡便，易獲取。在COPD患者痰液中分離出曲霉菌，尤其是反復分離獲得時，需要進一步完善胸部CT檢查，評估IPA的可能性。本研究所有病例均進行了痰液曲霉菌培養，痰液真菌培養對COPD患者IPA診斷的敏感性及特異性分別為33.3%、93.5%，特異性較高，但敏感性低，且痰曲霉菌培養耗時長，至少需要3 d，不利于IPA早期診斷。

熒光定量PCR檢測曲霉菌方法快速、敏感性高，多在粒細胞缺乏患者中開展研究，肺泡灌洗液PCR檢測的敏感性高于血清中PCR檢測[11]。由于不同文獻中描述的方法各不相同，缺乏統一標準，IDSA 2016年指南尚未推薦PCR檢測方法常規用于臨床診斷[6]。IDSA 2016指南建議臨床醫師根據個體情況謹慎選擇PCR作為IPA的診斷。臨床醫師須根據PCR試劑盒的方法學和檢測特點，對結果進行解讀。使用PCR方法診斷IPA，應結合其他診斷方法和臨床情況。目前，關于痰液PCR檢測的研究較少。本研究熒光定量PCR檢測痰液中的曲霉菌診斷COPD患者合并IPA的敏感性及特異性分別為72.2%、87.1%，陽性預測值和陰性預測值分別為76.5%、84.4%。敏感性顯著高于常規培養方法，但特異性較痰曲霉菌培養略低，可能與檢測敏感性高有關。

綜上所述，COPD患者中發生IPA并不少見，多見于全身應用糖皮質激素及廣譜抗生素的患者。該病確診困難，多依賴于臨床診斷，熒光定量PCR檢測痰液中的曲霉菌在COPD合并IPA的診斷中的敏感性和特異性均較高，能為臨床早期診斷提供重要的價值。但本研究選擇的痰液標本易污染，無法區分定植與感染，且未同時檢測血清及肺泡灌洗液，有待在后續研究中加以補充。