系統(tǒng)性紅斑狼瘡早發(fā)動脈粥樣硬化模型小鼠的建立

郭曉玲，朱春紅

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介導(dǎo)的,以免疫性炎性反應(yīng)為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，可造成皮膚、腎臟、血液等全身多系統(tǒng)受累。近年發(fā)現(xiàn)，SLE患者發(fā)生動脈粥樣硬化的風(fēng)險顯著增加， 50%以上患者存在中到重度動脈粥樣硬化，已成為導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。目前該病尚無根治辦法，而且常用治療藥物均不理想，不良反應(yīng)較多，嚴(yán)重影響遠(yuǎn)期預(yù)后和生存質(zhì)量。造成這些問題的根本原因是該病發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，人們對其發(fā)病規(guī)律及影響因素還缺乏全面認(rèn)識。因此，揭示SLE早發(fā)動脈粥樣硬化的核心發(fā)病機(jī)制，對于發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)和疾病治療具有重要意義。本研究通過小鼠模型的建立初步探討SLE早發(fā)動脈粥樣硬化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 降植烷購自Sigma公司；三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol ，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol ,HDL-C)、尿素氮(blood urea nitrogen ，BUN)、肌酐(creatinine, CRE)定量試劑盒等購自南京建成公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購于beyotime公司。

1.2 方法 選擇10只ApoE-/-敲除小鼠(ApoE-/-，C57BL/6背景，12周齡，雌性)為實(shí)驗組，10只C57BL/6小鼠為對照組，體質(zhì)量(22±2)g，均購自天津市奧臣實(shí)驗動物銷售有限公司(動物批號1601826)。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后開始實(shí)驗，實(shí)驗過程中對動物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗組ApoE-/-小鼠一次性腹腔注射降植烷0.5 ml/只，再高脂喂養(yǎng)8周建立模型，對照組C57BL/6小鼠腹腔注射等量生理鹽水，每組10只。實(shí)驗過程中觀察小鼠毛發(fā)、飲食、活動狀況等一般情況，繪制體重變化曲線。實(shí)驗結(jié)束后眼球取血，12 000 r/min離心，10 min，分離血清，凍存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，取各組小鼠腎臟組織，置中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片， HE染色，80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察各組小鼠腎臟組織形態(tài)變化。

1.3 觀察指標(biāo) 取兩組小鼠外周血樣本，根據(jù)試劑盒說明書，采用分光光度計檢測血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRE、BUN及腎功能指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠腎功能與血脂水平檢測結(jié)果 實(shí)驗組小鼠毛色暗淡甚至剝脫，活動減少，一般狀態(tài)較差。實(shí)驗組CRE、BUN腎功能指標(biāo)明顯惡化，同時TC、TG及LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C水平明顯降低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2.2 組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗組腎小球細(xì)胞增多、腫大，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管空泡變性，基底膜異常增厚，系膜增生(圖1)。

表1 兩組小鼠腎功能、血脂水平比較

表1 兩組小鼠腎功能、血脂水平比較

指標(biāo)對照組實(shí)驗組CRE(μmol/L)3.48±1.0336.87±3.89①BUN(mmol/L)1.86±0.9512.72±3.09①TC(mmol/L)6.52±3.4017.53±2.32①TG(mmol/L)0.49±0.14 1.30±0.21①LDL-C(mmol/L)0.30±0.301.25±0.33①HDL-C(mmol/L)1.66±0.17 0.79±0.17①

注：與對照組比較，①P<0.01

圖1 兩組小鼠腎臟組織HE染色特點(diǎn)(HE，×400)

3 討 論

SLE是一種以產(chǎn)生自身抗體，免疫復(fù)合物沉積，巨噬細(xì)胞組織浸潤及組織損傷為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，近年來，隨著醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展，其預(yù)后顯著改善，生存期和總體預(yù)后均有所提高。但是，生存期延長易導(dǎo)致患者重要臟器，如心血管受累，使得動脈粥樣硬化性心血管疾病成為SLE疾病后期最重要的并發(fā)癥之一，亦成為SLE遠(yuǎn)期死亡的主要原因[2]。進(jìn)一步揭示，SLE本身引起的慢性血管炎性反應(yīng)性改變和長期的免疫系統(tǒng)紊亂是導(dǎo)致SLE患者動脈粥樣硬化性疾病發(fā)病增加的一個主要原因，即使努力控制已知危險因素后, SLE 患者出現(xiàn)心血管事件的相對危險率仍高出健康人10倍。因此，SLE早發(fā)動脈粥樣硬化的研究日益受到關(guān)注，而理想的動物模型是對深入探討疾病機(jī)制及提出有效防治對策的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究以ApoE突變小鼠作為研究對象，采用自發(fā)性動脈粥樣硬化小鼠模型，結(jié)果顯示實(shí)驗組血清CRE、BUN水平比正常對照小鼠顯著增加，同時實(shí)驗組腎臟組織形態(tài)明顯改變,腎小球細(xì)胞增多、基底膜異常增厚、系膜細(xì)胞增生，證實(shí)動脈粥樣硬化小鼠具有狼瘡樣臨床表現(xiàn)。

目前，國內(nèi)外已建立多種SLE合并動脈粥樣硬化模型小鼠，但是成功率有限。文獻(xiàn)[3]發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性模型MRL/lpr狼瘡鼠即使予以高脂喂養(yǎng)也幾乎不能出現(xiàn)動脈粥樣硬化病變。另外，有研究人員通過將同品系的Fas-/-小鼠，lpr(fas)或 gld(fasl)基因突變小鼠與ApoE-/-或 LDLr-/-小鼠交配繁殖；或通過誘發(fā)ApoE-/-或 LDLr-/-小鼠，均可成功建立SLE 伴動脈粥樣硬化模型[4-6]。但該方案繁殖純化周期較長，不確定因素較多。降植烷(Pristane)是可引起炎性反應(yīng)和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的類異戊二烯烷烴，可被單核吞噬細(xì)胞吞噬，使T、B淋巴細(xì)胞增殖聚集，通過線粒體損傷途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生核抗原，由于T細(xì)胞高度活化、B細(xì)胞反應(yīng)性增高，產(chǎn)生多種抗體，啟動自身免疫反應(yīng)，常常能成功誘發(fā)狼瘡[7]。有研究報道，應(yīng)用Pristane誘導(dǎo)小鼠建立動物模型所涉及的小鼠種類、周齡、Pristane劑量等均有差異，尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[8，9]。因此，本研究采用ApoE-/-小鼠腹腔注射Pristane建立SLE伴發(fā)動脈粥樣硬化模型，以期為充實(shí)SLE早發(fā)動脈粥樣硬化動物模型的資料提供更多依據(jù)。結(jié)果顯示，12周齡實(shí)驗組小鼠注射Pristane后即可呈明顯的狼瘡表現(xiàn)，而一般自發(fā)性動脈粥樣硬化模型鼠出現(xiàn)SLE癥狀約需20周以上，可見Pristane刺激能大大縮短實(shí)驗周期。同時，實(shí)驗組小鼠腎炎性反應(yīng)癥狀明顯，組織形態(tài)學(xué)顯示腎小球硬化和主動脈動脈粥樣硬化，血CRE和BUN等腎功能檢測指標(biāo)顯著升高，血脂水平異常，具有和臨床相似的狼瘡表型及動脈粥樣硬化表現(xiàn)，表明成功構(gòu)建SLE合并動脈粥樣硬化小鼠模型。

綜上所述，SLE是發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的自身免疫性疾病，對其進(jìn)行有效的干預(yù)治療已取得巨大進(jìn)展，近年來，主要通過自發(fā)性和實(shí)驗性誘導(dǎo)動物模型進(jìn)行更深入病因和發(fā)病機(jī)制的探索，因此建立便利、穩(wěn)定的模型動物具有重要意義。本研究使用Pristane誘導(dǎo)自發(fā)性動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠建立SLE合并動脈粥樣硬化動物模型，制備方法簡便，一次注射即可。此外，與自發(fā)性動物模型病程較長不同，該造模方案實(shí)驗周期短，對實(shí)驗條件的要求相對較低，且實(shí)驗復(fù)制成功率高，能夠獲得與人類相似的發(fā)病情況。因此，本研究建立的動物模型可為進(jìn)一步揭示疾病的發(fā)病機(jī)制及探索新的治療策略提供借鑒作用。