蝦青素乳油的研究與開發
——基于酵母菌的深層發酵

譚麗娟，朱文婷，陳洪彪，代萬富，黃紹鴻，于 敏

(武漢工商學院 環境與生物工程學院，湖北 武漢 430065)

1 引言

蝦青素屬于一種萜烯類不飽和化合物，為一種廣泛存在于生物界的酮式類胡蘿卜素[1]。蝦青素因具有很強的生物活性而具有廣闊的應用市場，其作用包括具有抗疲勞抗氧化的作用[2]；其抗氧化與抗炎作用可保護神經元[3]；在抗腫瘤方面也有一定的作用，其機理可能與抑制PPARγ表達有關[4]；在增強免疫力及視力方面有一定的效果[5]；具有著色功能，是很好的天然紅色素等。目前蝦青素主要來源的菌種是雨生紅球藻和紅法夫酵母[6]，而所產生的蝦青素產量比較低，本項目就利用酵母制備蝦青素乳油，旨在提高乳油中蝦青素含量，所以本課題具有一定的研究意義和價值，可為相關產品的工業化生產提供技術路線。

2 材料、試劑及培養基

菌株：酵母菌，由武漢工商學院實驗教學中心環境與生物工程分中心保存。

主要試劑：DMSO(AR)、正己烷(AR)、丙酮、NaOH(AR)、二氯甲烷(AR)、石油醚(AR)、葡萄糖(BR)、酵母浸膏(BR)、蔗糖(AR)、牛肉膏(BR)，均來自天津市凱通化學試劑有限公司；蝦青素標準樣，Sigma公司；番茄紅素，江蘇采薇生物科技有限公司。

主要儀器：SPX-100B-D型振蕩培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、SPX-250B-Z型生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、旋轉蒸發儀RE52CS(上海亞榮生化儀器廠)。

培養基：葡萄糖10 g/L；蔗糖10 g/L；酵母膏10 g/L；牛肉膏2.5 g/L；瓊脂粉20 g/L。

3 實驗方法

3.1 標準曲線的制作方法

用100 mg/L蝦青素標準溶液和DMSO-丙酮混合液配制2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L等一系列濃度的蝦青素標準溶液，在波長為478 nm的條件下分別測定其吸光度，以蝦青素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

3.2 菌種活化與培養

用接種環挑取酵母菌于液體培養基中活化，活化后的菌種接于種子培養基搖瓶培養，培養條件：溫度22 ℃，時間18 h，轉速150 r/min。

將種子液按1∶10接入培養基，于培養箱中搖瓶培養，約25 h后取出培養瓶并向其中加入濃度分別為0 μg/g、20 μg/g、40 μg/g、60 μg/g、80 μg/g的番茄紅素，以引入蝦青素合成前體物質[7]，繼續搖瓶培養15 h，培養條件：溫度22 ℃，轉速150 r/min。

3.3 蝦青素的提取

3.3.1 不同破壁方法提取蝦青素

分別利用機械法、化學法、自溶法對菌體進行破壁處理。機械法采用研磨法用丙酮作為助磨劑處理菌體；化學法采用DMSO溶液70 ℃條件下處理菌體；自溶法利用NaCl溶液作為質壁分離劑，在pH值為7、溫度為55 ℃條件下自溶3 h，處理后離心。

3.3.2 不同破壁時間提取蝦青素

取一定量離心所得的菌體，加入DMSO-丙酮混合液，在40 ℃的條件下分別破壁處理20 min、40 min、60 min、80 min、100 min。在478 nm波長下測定樣品液的吸光度。

3.4 蝦青素提取液的萃取與濃縮

將蝦青素粗品于分液漏斗，加入約其1/2體積的石油醚，邊加邊振蕩，靜置分層后加入石油醚等體積的無水乙醇及適量蒸餾水，去除乙醇相，將石油醚相進行蒸發濃縮(條件：真空度0.08 MPa，溫度30 ℃)，產品于烘箱避光干燥。

3.5 蝦青素的皂化

分別配制濃度為20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L的NaOH溶液并與乙醇混合制成質量濃度為40.3 kg/m3的混合液；取濃縮干燥所得樣品按1∶5溶于二氯甲烷溶液中，充分溶解后，按1∶5加入乙醇-NaOH混合液，置磁力攪拌器上進行皂化，20 min后加入適量蒸餾水直到反應混合液迅速出現分相時停止皂化反應，收集下層有色相得皂化產品，于冰箱中冷藏，待二氯甲烷相完全澄清，分液，進行真空濃縮。

分別取少量干燥后的產品溶于DMSO-丙酮混合液，在478 nm波長下測定吸光度。

3.6 制備蝦青素乳油的方法

在以上考察因素最佳條件下進行發酵與提取，真空干燥得蝦青素，向所得蝦青素中按1∶10的比例加入大豆油，使蝦青素充分溶于大豆油中，加入乙醇溶液，充分反后轉入旋轉蒸發儀中，將未反應的乙醇溶液蒸出，既得蝦青素乳油。

4 結果與分析

4.1 標準曲線的制作

蝦青素標準樣的標準曲線如圖1，標準曲線方程為：y=0.0855x+0.0154，R2為0.9987，表明蝦青素質量濃度在0～12 μg/mL范圍內線性關系良好。

4.2 前體物質對蝦青素產量的影響

向各組發酵液所得菌體中加入DMSO-丙酮混合液處理20 min，測定各組樣品液吸光度，得前體物質加入量與蝦青素濃度關系如表1所示。從實驗數據得出，向培養基中引入蝦青素合成前體物質可顯著增加蝦青素合成率，并非前體物質加入量越多越好，在番茄紅素加入量為60 μg/mL時，樣品中蝦青素含量最高，濃度為5.32 μg/mL，但當番茄紅素加入量為80 μg/mL時，反而不利于蝦青素的合成。

4.3 不同破壁方法對蝦青素提取的影響

運用不同的破壁方法處理菌體，測定其中蝦青素含量，得蝦青素濃度與破壁方式的關系如表2所示；表明利用化學方法對菌體細胞進行破壁處理所得蝦青素含量相較于研磨法和自溶法高，可達到2.29 μg/mL，故在蝦青素的提取過程中宜采用化學方法對菌體細胞進行破壁處理，以提高蝦青素的提取率。

表1 前體物質對蝦青素合成的影響

表2 不同破壁方法對蝦青素提取的影響

4.4 不同破壁時間對蝦青素提取的影響結果

利用DMSO-丙酮混合液對菌體壁以不同時間處理后測定蝦青素含量，得吸光度最大值為0.531，從圖2知，在破壁處理過程中，處理60 min為宜；處理時間在20～60 min的時間范圍內，處理時間越長，樣品液中的蝦青素含量越高，但處理時間超過60 min以后，樣品液中蝦青素的含量卻有所下降。故破壁處理時，處理的時間不宜過長。

圖2 不同處理時間對蝦青素提取含量的影響

4.5 不同濃度的堿對皂化效果的影響

利用不同濃度的NaOH溶液對提取液進行皂化處理后于478 nm的波長下測定吸光度，得樣品液中蝦青素含量與堿濃度的關系如圖3所示，隨著堿濃度的升高，樣品皂化效果越好，當堿濃度為20 g/L時，蝦青素的皂化效果達到最好，其濃度為5.27 μg/mL，當堿濃度超過20 g/L時，蝦青素的濃度呈下降趨勢。

圖3 堿濃度對蝦青素皂化影響

4.6 蝦青素乳油的制備

圖4為試驗各項考察因素最優條件下得到的蝦青素乳油產品，顏色呈現為橘紅色，為不透明乳狀物。

圖4 蝦青素乳油

5 結論

通過對培養條件、提取方法的優化，可明顯提高蝦青素提取率；培養條件優化后得其濃度為5.32 μg/mL，相比優化前增加了2.85 μg/mL；化學方法對菌體進行破壁處理，得濃度為2.29 μg/mL，較機械法和自溶法的提取量分別增加0.69 μg/mL、1.17 μg/mL；通過對比破壁時間對蝦青素提取效果，優化后得濃度為5.96μg/mL，相比優化前增加了2.02 μg/mL；通過皂化過程不同濃度NaOH溶液對蝦青素提取效果的考察，優化后濃度為5.27 μg/mL，較優化前濃度提高了4.15 μg/mL；綜上得前體物質、NaOH溶液濃度兩個因素對蝦青素的提取影響最大。通過對培養條件和提取方法的研究，使獲得的蝦青素濃度較近年的報道有較大提升，試驗中隨蝦青素產率的提升，相應的蝦青素在乳油中濃度也會提升，不僅降低了成本，也可為蝦青素提取率的提高及其產品的制備提供技術路線，為其工業化發展奠定了基礎。