甘膽酸試劑盒的性能評價

李忠信，謝茜，周方方，付光宇(通信作者)

鄭州安圖生物股份有限公司 (河南鄭州 450016)

近年來，磁微粒化學發光免疫分析技術結合化學發光免疫檢測技術和磁微粒載體技術的優勢，使得免疫檢測靈敏、快速、準確及特異度強，因此得到了快速發展。本公司應用磁微粒化學發光免疫分析技術在血清甘膽酸的免疫檢測上，評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能。甘膽酸是肝膽疾病的主要診斷指標，近年來文獻[1-2]報道該項目與肝纖維化血清標志物聯合檢查在肝損傷、肝癌、肝硬化等疾病方面具有較高的診斷價值，例如妊娠肝內膽汁淤積癥(ICP)患者甘膽酸、血脂水平變化顯著，可以作為ICP診斷敏感可靠的指標，對ICP的早期診斷及檢測具有重要的臨床意義[3]；劉茵等[4]認為血清甘膽酸是評價肝細胞功能及肝膽系物質循環功能的敏感指標之一，肝炎后肝硬化患者甘膽酸水平明顯升高。王昉等[5]認為血清甘膽酸可較為靈敏地反映新生兒肝功能病變，對新生兒高膽紅素血癥的診斷具有重要價值。張有濤等[6]認為甘膽酸可反映肝細胞的受損程度及肝損害的動態過程，對肝臟疾病的判斷和治療具有重要的診斷價值。

甘膽酸是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一，相對分子質量為465.6。肝細胞受損時，攝取甘膽酸能力下降，致使血液中甘膽酸含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，返流血液循環的甘膽酸增高，使得血清甘膽酸含量增高[7]。因此，測定血清甘膽酸是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一，且在甘膽酸與血清Ⅳ型膠原、透明質酸、前白蛋白(PA)進行動態聯合檢查對肝損傷、肝癌、肝硬化、肝膽胃腸消化系統及預后判斷等方面具有極其重要的診斷價值[8]。

本公司旨在為臨床慢性肝炎、輕度肝硬化、肝癌等疾病的診斷提供可靠的分析指標，建立一種靈敏度高、速度快、準確度高及特異度強的甘膽酸磁微粒化學發光免疫分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑盒為鄭州安圖生物工程股份有限公司自制；參比試劑盒為蘇州博源醫療科技有限公司試劑盒；儀器為安圖生物Autolumo A2000全自動化學發光測定儀。

1.2 方法

1.2.1靈敏度建立方法

根據EP17-A2[9]選擇5份接近0值的臨床樣本，每個樣本測定3次，測定4 d，進行空白限(LOB)的建立。選擇1～4倍LOB的5份臨床樣本，每個樣本測定3次，測定4 d，進行檢出限(LOD)的建立。

1.2.2準確度評估方法

1.2.3試劑盒精密度評估

根據EP05-A3[11]，評估試劑盒的批內、批間及總不精密度。

1.2.4試劑盒線性范圍評估方法

根據CLSI EP06-A[12]文件，建立本試劑盒的線性范圍。選擇線性范圍上限100%～130%的臨床樣本10份，用低值樣本依次稀釋制備10個系列的評價樣本(每個樣本測定4次)。

采用平均斜率法分析實驗結果，以X表示各樣本的預期值，以Y表示各樣本的實測均值，形成10對預期值、實測值，用直線回歸對數據進行處理，得到10組線性回歸方程(表1)。

1.2.5藥物干擾

于臨床樣本中添加25種臨床常見治療藥物，檢測25種臨床常見治療藥物對檢測結果的干擾。

1.2.6參考值范圍的確定

根據EP28-A3C[13]，采用本試劑盒建立一個足夠可靠和實用的參考區間。利用醫學統計軟件SPSS 19.0，采用K-S檢驗，樣本檢測值呈正態分布。故采用95%百分數范圍的正態分布法，建立參考值范圍。

2 結果

2.1 試劑盒的靈敏度

選用“1.2.1”的實驗方法，本試劑盒的LOB為0.05 μg/ml，LOD為0.30 μg/ml，功能靈敏度(FS)為0.40 μg/ml。

2.2 試劑盒的準確度

選用“1.2.2”的實驗方法，本試劑盒的回收率為85.20%～113.40%。

2.3 試劑盒的精密度

選用“1.2.3”的實驗方法，3批試劑盒的批內精密度<8% ，批間精密度<10%，總不精密度<15%。

2.4 線性范圍的建立

選用“1.2.4”的實驗方法，建立本試劑盒的線性范圍。表1為10份樣本的線性回歸方程和線性相關系數R2。

表1 10份樣本的線性回歸方程

在完全理想狀態下，實測值和預測值間的回歸線為通過原點、斜率為1的直線，即斜率b1為1，截距b0為0。由表1可知，10份樣本回歸方程b1在1.00±0.03范圍內，b0近于0。通過表1進行分析，確定線性范圍1～50 μg/ml。

2.5 臨床治療藥物影響評估

于臨床樣本中添加25種常見治療藥物，25種藥物對本試劑盒檢測結果無干擾，臨床偏差在8%以內。

2.6 試劑盒的參考值范圍

由于個體差異及地域、年齡和性別的不同，不同人血清中的甘膽酸含量會有一定的差異。選用“1.2.6”的實驗方法，本試劑盒建立的參考值范圍為0～2.7 μg/ml。該參考值范圍與蘇州博源醫療科技有限公司一致。

2.7 臨床研究

使用本試劑盒與蘇州博源醫療科技有限公司試劑盒同時測定604份臨床樣本，對實驗結果進行泊松相關系數分析，回歸方程Y=0.9515X-0.3613，相關系數R2=0.9018。

3 討論

在本試劑盒性能指標的建立過程中，建立了靈敏度、線性范圍、回收率、精密性、參考值范圍等性能指標。肝纖維化四項1 000 ng/ml透明質酸、100 ng/ml Ⅲ型前膠原氨端肽、1 000 ng/ml Ⅳ型膠原和800 ng/ml層粘連蛋白，以及400 μg/ml孕酮、170 μg/ml睪酮對本試劑盒檢測結果無影響，另外25種臨床診斷藥物對本試劑盒的檢測也無影響，這些性能指標保證了檢測結果的準確、可信。

蘇州博源采用均相酶免疫法進行測定，存在一定的方法學限制，靈敏度、精密性較低。本研究采用磁微粒全自動化學發光免疫分析方法，靈敏度和精密性得到顯著提升。

在臨床研究過程中，本試劑盒與參比試劑盒測定值高度相關，即該試劑盒與參比試劑盒的測定結果具有較高的符合度，具有同等的臨床診斷價值。甘膽酸對于肝病樣本的檢出率為60%左右，肝病和肝硬化樣本的陽性率大致相同，聯合肝纖維化四項檢測意義重大，有助于臨床醫師對結果進行解讀。在人體內甘膽酸正常代謝途徑為腸-肝循環，甘膽酸由肝細胞合成，經毛細膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進入十二指腸[8]，因此甘膽酸與肝臟關系極為密切。肝臟的代謝與攝取能力將直接影響體內甘膽酸的水平，肝病患者的肝臟代謝與攝取能力降低，因此體內甘膽酸含量顯著升高，試劑盒檢測結果與臨床診斷結果一致。

綜上所述，本研究建立的甘膽酸磁微粒化學發光定量免疫分析方法靈敏度高、測定速度快、準確度高及特異度強，利于臨床研究的開展，可為多種疾病的臨床治療提供可靠的性能指標。