育成期舍飼藍狐結腸菌群多樣性分析

■陳雙雙 司華哲 蔡熙姮 張如春 張新宇 史鴻鵬 李光玉 劉晗璐*

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林長春130112; 2.吉林農業大學，吉林長春130118）

藍狐（Alopex lagopus），食肉目，犬科，是我國飼養的主要裘皮動物之一。藍狐腸道較短，僅為體長的3.5～4 倍，食物在腸道中停留時間短，排空速度快[1]。隨著產業發展，目前在藍狐繁殖育種、疾病防控、營養需要量、毛皮發育等方面開展了大量的研究[2-5]，但對于藍狐的腸道微生態系統及功能的研究較少。腸道微生物區系作為動物體最復雜的微生態系統，被稱為動物重要的代謝“器官”，參與機體營養物質的消化吸收及能量代謝過程，而且參與機體的免疫過程，并對動物健康具有重要影響[6-9]。本團隊前期研究發現，河北昌黎地區雄性藍狐糞便微生物中以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門為主，其中厚壁菌門含量最高。在屬水平上以鏈球菌屬、乳桿菌屬、普雷沃菌屬、巨型球菌屬、柯林斯菌屬為主[10]。但對于飼養條件下藍狐腸道微生物的組成與分類仍未得到充分研究，此外關于藍狐腸道菌群與宿主營養物質利用的研究也很缺乏，本研究作為藍狐腸道菌群組成及功能研究的一部分，運用高通量測序及數據分析技術，研究藍狐腸道菌群的組成，為未來藍狐營養物質利用乃至日糧調配提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018 年8 月從吉林地區的農業部長白山野生生物資源重點野外科學觀測試驗站隨機選取6 只健康（精神狀態正常、采食均衡、生活環境良好）的育成期（3～4月齡）雌性舍飼藍狐（J1～J6），對其心臟注射5 ml的琥珀乙酰膽堿處死后，立即取結腸后段內容物。現場采集15 g藍狐結腸后端內容物，立即用無菌分裝袋收集分裝于5 ml的凍存管中（分裝于3個管，每管5 g），放入液氮罐中速凍后帶回實驗室，備后續分析。藍狐飼糧為養殖場中日常飼糧，日糧組成及營養水平滿足育成期藍狐營養需要，如表1所示。

表1 藍狐飼糧組成及營養水平（風干基礎，%）

1.2 樣品處理

1.2.1 細菌總DNA的提取及測序

對藍狐結腸食糜樣品中細菌基因組DNA的提取按照Fast DNASPIN as Kit for Feces 說明書進行[10]。提取的基因組DNA 經1%的瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，電泳23 min，Marker 為λⅢDNA Maker）檢測，DNA 產物在14 000 bp 左右。將目的DNA 送至北京諾禾致源科技股份有限公司，基于IonS5TMXL測序平臺，利用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對目的基因的V3～V4 區進行單端測序（Single-End），利用單端測序的方法構建小片段文庫。

1.2.2 生物信息學分析

使 用Cutadapt（V1.9.1,http：//cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先對reads 進行拼接、過濾去雜得到有效信息有效數據（Clean Reads）。利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/)Clean Reads 進行聚類，設定具有97%以上相似度的序列為1 個操作分類單元（OTU），對OTUs 序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數據庫數據庫進行物種注釋分析，并在各分類水平下統計不同培養基中藍狐糞便菌群組成。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Alpha指數和Beta 指數，并用R 軟件（Version 2.15.3）對不同培養液中的細菌組成進行組間差異性分析以及組間差異物種分析。

1.3 數據處理

數據用Excel 2013進行整理并用SAS 9.4軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 多樣性指數分析

本研究基于高通量測序技術對6 只健康藍狐結腸菌群的16S rDNA 的V3～V4 區進行測序。6 個樣品共獲得377 798 條有效序列，平均為62 966 條有效序列，其中J1 的有效序列數最少為46 921 條，J6的有效序列數最多為80 249 條。在97%相似度下進行聚類分析，共獲得2 064 個OTU，平均為307 個OTU。

Alpha 多樣性指數分析表明，藍狐結腸菌群物種具有較高的多樣性和豐度。如表2 所示，其中Ace 指數（范圍為216～416，均值312）和Chao1 指數（范圍為201～393，均值296）為菌群物種豐度指數，Shannon指數（范圍為2.30～5.37，均值4.31）和Simpson 指數（范圍為0.649～0.953，均值0.869）為菌群物種多樣性指數。

表2 樣本測序數據分析

圖1 稀釋曲線（A）和等級聚類曲線（B）

如圖1(A)所示，當測序數量超過25 000 時，各樣本曲線逐漸趨于平緩，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的物種。等級聚類曲線（Rank Abundance）作為常見的描述組內樣本多樣性的曲線，可直觀的反映樣本中物種的豐富度和均勻度[11]。如圖1(B)所示，隨著測序的深入，在水平方向上，曲線在橫軸上的跨度較大，物種的豐富度高；在垂直方向上，曲線趨于平緩，因此物種分布均勻。

2.2 門分類水平下菌群結構分析

圖2可見，在門分類水平上分析，6個樣本獲得的所有菌群歸類于12 個門，主要集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），含量均在1%以上，其中厚壁菌門為最優勢菌門。厚壁菌門平均含量為70.25%，擬桿菌門平均含量為22.36%，變形菌門平均含量為5.69%，放線菌門平均含量為1.13%，4 個菌門共占99.43%。

圖2 藍狐腸道菌群門分類的相對豐度

2.3 屬分類水平下菌群結構分析

在屬分類水平上分析，6 個樣本獲得的所有菌群歸類于180 個菌屬，圖3 為前30 的菌屬的相對豐度圖，表3 為前10 的菌屬所占比例。菌屬中比例大于1%共有15 個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）為最優勢菌屬，平均含量為28.50%；其次為巨單胞菌屬（Megamonas），平均含量為7.48%；隨后依次為擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)占7.41%；Peptoclostridium占6.33%；乳球菌屬（Lactococcus）占5.38%；Dialister占4.39%；巨型球菌屬（Megasphaera）占3.53%；Desulfovibrio 占2.97% ；擬 桿 菌 屬（Bacteroides）占2.48%；unidentified_Lachnospiraceae占2.38%，前10個菌屬共占70.85%。具體屬分類水平的相對豐度見圖3。

圖3 藍狐腸道菌群屬分類的相對豐度

3 討論

藍狐作為食肉動物，對高蛋白質、高脂肪的動物性飼料有較高的利用率[12-13]。研究發現，藍狐可耐受脂肪比例高達44%的日糧，而未見任何生理異常[13]，該現象是否與藍狐腸道微生物存在聯系仍需進一步研究。因此，本試驗利用高通量測序技術，對藍狐結腸菌群的組成與多樣性進行分析。

3.1 多樣性指數分析

Alpha 指數用于分析樣本菌群多樣性，反映樣本中細菌的多樣性和豐度[14]。Ace 指數和Chao1 指數反映菌群中物種豐度，其值越高則菌群中物種豐度越高；Shannon 指數和Simpson 指數反映菌群中物種多樣性，其值越高則菌群中物種多樣性越豐富[11]。覆蓋率（Coverage）代表樣品微生物群落被測出的概率[15]。如表2 顯示，本試驗樣品測序覆蓋率都在0.997 以上，說明本試驗樣品測試結果真實可靠。如圖1 所示，隨著測序數量的增加稀釋曲線趨于平坦，則說明隨著測序深度的增加幾乎不產生新的OTU。本試驗中OTU 均值為307，Ace 指數均值為311，Shannon 指數均值為4.31。本團隊前期對河北昌黎地區的雄性藍狐糞便中菌群進行了高通量測序分析，OTU 均值為509，Ace 指數均值為559，Shannon 指數均值為5.27[10]。與河北地區藍狐腸道菌群相比，藍狐腸道菌群中具有較低的物種豐度與多樣性，這中差異可能來自地域、日糧組成、年齡、性別以及測序方式帶來的差異。表1 所示，藍狐J5、J6 的Ace 指數和Chao1 指數較高為401、416 和393、386，則表明J5和J6兩只藍狐結腸微生物中具有較高的豐度。J3的Shannon 指數和Simpson 指數最低，則J3 結腸中微生物群落的多樣性最低。通過Alpha 指數分析表明，與其它藍狐相比，藍狐J3 結腸中菌群具有較低的豐度和多樣性，其原因可能與動物個體的生理狀態和遺傳因素有關。

表3 藍狐腸道不同菌屬所占比例(%)

3.2 菌群結構與物種豐度分析

從門分類水平分析，藍狐結腸前五的優勢菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria、梭桿菌門（Fusobacteria），與狼、豺、家犬等犬科動物腸道菌群研究結果一致[16-19]。6 只藍狐中J3、J6結腸中最優勢菌門Firmicutes 所占比例高達98.17%、89.02%。研究發現，Firmicutes 與脂肪、蛋白質的消化有關，藍狐作為以高蛋白質、高脂肪的動物性飼料為食的肉食動物，因此，Firmicutes 有促進日糧營養消化吸收的作用[20-22]。研究表明，Bacteroidetes 與類固醇、膽汁酸、糖類代謝有關，對多糖的吸收和蛋白質的合成具有促進作用[23]。大量研究發現，在動物腸道中Firmicute s 和Bacteroidetes 的比例與動物個體的肥胖程度有關，肥胖個體腸道中Firmicutes 的比例升高、Bacteroidetes 的比例下降，當動物腸道中Firmicutes 豐富度增加，Bacteroidetes 豐富度降低時，發現飲食過程中動物體對能量的攝入量增多[23-25]。因此，藍狐J3、J6 個體對脂肪和蛋白質等具有較強的吸收能力，但本試驗并未對藍狐體重水平進行觀察。藍狐、水貂同為我國主要的毛皮動物，研究表明，水貂結腸菌群中較豐富的5 個菌門為Firmicutes(60.0%)、Bacteroidetes(16.2%)、Fusobacteria（11.5%）、Actinobacteria（5.9%）和Proteobacteria(5.3%)[26]。與藍狐結腸菌群相比，水貂結腸菌群中Fusobacteria 所占比例較高，其它菌門種類與藍狐結腸菌門類似。研究發現，在動物腸道中Fusobacteria 所占比例與動物飼糧中纖維含量有關，當飼糧中纖維含量較少時，Fusobacteria 所占比例增加[27]。與水貂飼糧相比，藍狐飼糧中纖維含量較高，因此可能導致藍狐結腸菌群中Fusobacteria所占比例較低。同時，研究發現，草食動物馬的腸道菌群中沒有發現Fusobacteria細菌的存在[28]；而人腸道菌群中Fusobacteria 所占比例不足1%[29]。因此，動物腸道中Fusobacteria 所占比例可能受飼糧中植物性飼料組成的影響。

從屬分類水平分析，藍狐結腸菌群中優勢菌屬為Lactobacillus、Megamonas、Alloprevotella、Peptoclostridium、Lactococcus、Dialister、Megasphaera、Desulfovibrio、Bacteroides、unidentified_Lachnospiraceae，而藍狐糞便菌群中的優勢菌屬為Streptococcus、Lactobacillus、Prevotella、Megasphaera、Collinsella、Blautia、Bacteroides、Alloprevotella、Peptoclostridium、Megamonas，與藍狐糞便菌群結果存在差異性，其原因可能與藍狐地域、品種、年齡、性別等有關系[30-32]。Lactobacillus 屬于Firmicutes，其作為益生菌受到人們的廣泛關注。研究發現，在動物體中，Lactobacillus存在于動物體的許多部位，如消化系統、泌尿系統和生殖系統，構成微生物群的重要組成部分[33]。在動物腸道中Lactobacillus代謝物丁酸鈉以及有機酸等的存在，引起腸道內環境pH 值的降低，抑制有害菌的生長；Lactobacillus 能產生過氧化氫，在體外和體內抑制白色念珠菌的生長和毒力，并通過減少白念珠菌生物膜的形成來降低其致病性[34]。體外研究也表明，Lactobacillus 通過產生有機酸和某些代謝物來降低白色念珠菌的致病性[35]。研究發現，Lactobacillus 與其他益生菌聯合使用可幫助治療腸易激綜合癥(IBS)，當腸道微生物群中條件致病菌含量過高時，益生菌可以恢復體內微生物菌群的平衡[36-37]。此外，Lactobacillus作為益生菌還可治療由潰瘍引起的幽門螺桿菌感染[38]。Lactococcus 原屬于Streptococcus的N1群的一種菌屬，其唯一產物乳酸可調節環境條件pH值，從而阻止腐敗細菌的生長，但國內外鮮有報道[39-40]。Bacteroides在動物腸道中主要參與動物蛋白質、氨基酸和脂肪的代謝，當日糧中蛋白質和動物脂肪含量高時會使Bacteroides 比例提高[41]。與河北昌黎地區藍狐相比，吉林左家地區藍狐結腸菌群中Prevotella、Blautia含量減少。研究發現，Prevotella主要參與植物蛋白質的代謝，同時在瘤胃中還具有分解纖維素的能力[42]；Blautia在瘤胃中主要具有降解半纖維素的能力[43]，兩種菌屬的比例與動物的日糧有關，當日糧中纖維素水平增加時，該類菌群含量增加，但該類細菌在藍狐腸道中的作用仍有待進一步研究確定。與河北昌黎地區藍狐糞便菌群組成相比，吉林左家地區藍狐結腸菌群組成存在差異性的原因除飼養環境、品種和研究方法不同外，也可能是飼糧配方不同造成的[44]。屬水平上個體間差異性分析顯示，J3結腸菌群中Peptoclostridium所占比例較高，其它菌屬所占比例較低；J2 和J4 結腸菌群中Lactobacillus 所占比例較低，同時J2結腸菌群中Alloprevotella所占比例較高。研究發現在生活環境、性別、年齡、飼糧水平相同的情況下，動物腸道菌群組成和多樣性還受到動物的遺傳因素的影響[33]。因此，即使在相同環境下的不同個體間腸道中的微生物群落的組成和多樣性也可能存在一定的差異性。

4 結論

本試驗飼糧條件下的6 只藍狐結腸菌群分布于12 個菌門，主要為Firmicutes（70.25%）、Bacteroidetes(22.36%)、Proteobacteria(5.69%)、Actinobacteria(1.13%)，4個菌門共占99.43%；所有菌門分布于180個菌屬，組成豐富多樣化的腸道菌群，在屬的分類水平上Lactobacillus所占比例最高，為28.50%；其次為Megamonas，占7.48%。