體外產(chǎn)氣法評估蕎麥秸稈、油菜、苜蓿干草和玉米青貯的組合效應(yīng)

■李海慶 王 萌 周玉香

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021)

我國秸稈種類較多，但動(dòng)物消化率較低，利用率不高[1]。蕎麥在我國種植廣泛，蕎麥秸稈也是一種較好的粗飼料來源[2]。近年來我國油菜因其生產(chǎn)總量呈持續(xù)增長的趨勢，也成為了重要的農(nóng)作物秸稈之一[3]。苜蓿是一種蛋白含量高的豆科飼草。研究證明，秸稈作為日糧中唯一的粗飼料時(shí)，無法在瘤胃微生物中完全發(fā)酵，容易造成消化率降低[4]，通過將低質(zhì)的秸稈與其它優(yōu)質(zhì)的粗飼料進(jìn)行組合飼喂，可以提高秸稈的利用率，緩解我國秸稈資源浪費(fèi)等問題[5]。布同良（2006）[5]通過體外產(chǎn)氣法研究在日糧中用青貯玉米與羊草組合時(shí)，可產(chǎn)生正組合效應(yīng)。張吉鹍等（2007）[6]研究在玉米秸稈日糧中補(bǔ)充40%～60%的苜蓿可以更高效的利用秸稈資源。

本試驗(yàn)擬采用體外培養(yǎng)技術(shù)，通過將蕎麥秸稈、油菜、苜蓿干草和青貯玉米進(jìn)行不同比例的組合搭配，在體外進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。通過檢測多項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)，用以評估這幾種粗飼料的組合效應(yīng)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選用4月齡，體重在23 kg左右，體況良好的灘羊公羊3只，進(jìn)行瘤胃瘺管手術(shù)，待瘤胃瘺管固定后護(hù)理30 d開始試驗(yàn)。試驗(yàn)前，對圈舍進(jìn)行消毒，對羊只進(jìn)行驅(qū)蟲、健胃等管理。飼養(yǎng)日糧按照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T816—2004）合理配制營養(yǎng)全面的基礎(chǔ)日糧。基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)配方見表1。每日飼喂2次，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)配方（DM基礎(chǔ)）

稱取4.0 g精粗比為3∶7的日糧作為體外培養(yǎng)底物，精料按照基礎(chǔ)日糧配方中的精料配方。粗飼料按照粉碎過40目篩后的蕎麥秸稈、油菜、苜蓿干草和青貯玉米按不同配比組合。組合比例（%）為油菜20∶青貯80，蕎麥20∶苜蓿80，蕎麥40∶苜蓿60，油菜20∶苜蓿80，油菜40∶苜蓿60，蕎麥20∶青貯80。并按此組合順序設(shè)定為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，Ⅰ組設(shè)定為對照組。每種組合3個(gè)重復(fù)，采用體外發(fā)酵技術(shù)，在0、3、6、12、24 h測得各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵指標(biāo)，最后所測值根據(jù)組合效應(yīng)綜合指數(shù)（MFAEI）的計(jì)算公式，整理數(shù)據(jù)。

1.2 體外試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.2.1 瘤胃液采集

試驗(yàn)期間在早飼前通過瘤胃瘺管抽取瘤胃液，取出后立即放入預(yù)熱39 ℃并通有CO2的保溫瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室。隨后經(jīng)8層紗布過濾后迅速分裝進(jìn)通有CO2的恒溫培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶裝入40 ml瘤胃液。

1.2.2 培養(yǎng)液制備

培養(yǎng)液參照張愛忠(2005)[7]的方法進(jìn)行配制，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入80 ml 培養(yǎng)液。試驗(yàn)前39 ℃預(yù)熱并通入CO2。

1.2.3 模擬人工瘤胃產(chǎn)氣裝置

取250 ml 培養(yǎng)瓶，置于恒溫水浴搖床中，搖床溫度設(shè)置為39 ℃、搖速50次/min。試驗(yàn)過程中培養(yǎng)瓶內(nèi)產(chǎn)生的氣體可排出到注射器，用于記錄產(chǎn)氣量，記錄后將氣體通過三通閥注入集氣袋中，用于檢測甲烷含量。

1.3 測定指標(biāo)與方法

各試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束后，分別統(tǒng)計(jì)和測定各組合的產(chǎn)氣量、pH值、干物質(zhì)消化率、氨態(tài)氮濃度、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、微生物蛋白（MCP）、甲烷含量。

1.3.1 產(chǎn)氣量的測定

分別在發(fā)酵開始后0、3、6、12、24 h通過三通閥上端的注射器讀取并記錄不同時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量。

1.3.2 pH值的測定

發(fā)酵結(jié)束后用pHS-2 型酸度計(jì)直接測定培養(yǎng)瓶中的瘤胃液的pH值。

1.3.3 干物質(zhì)消化率的測定

1.3.4 氨態(tài)氮濃度的測定

參照馮宗慈等（1993）[8]的方法測定。

1.3.5 揮發(fā)性脂肪酸的測定

用GC-2010 氣相色譜儀測定。汽化室中載氣為N2，分流比為20∶1，溫度250 ℃，筑爐溫度100 ℃，火焰監(jiān)測器(FID)溫度250 ℃，檢測器載氣為H2流量40 ml/min，空氣流量450 ml/min。檢測樣品進(jìn)樣量為1 μl。

1.3.6 微生物蛋白的測定

用差速離心法將，將細(xì)菌沉淀，再用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定[8]。

1.3.7 甲烷排放量的測定

利用島津GC-2010 氣相色譜儀測定。測定條件為筑爐溫度60 ℃，檢測器70 ℃；載氣為氮?dú)?N2)，檢測樣品進(jìn)樣量為1 ml/次。

甲烷排放量=產(chǎn)氣量×每毫升甲烷濃度

1.3.8 單項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)及多項(xiàng)組合效應(yīng)綜合指數(shù)的計(jì)算

式中：A1——對照組各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)數(shù)值；

A2——各組各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)數(shù)值；

A3——在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)A2總和的平均數(shù)。

多項(xiàng)組合綜合效應(yīng)指數(shù)（MFAEI）為各單項(xiàng)指標(biāo)的加和值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 記錄并作簡單處理后，采用SAS 8.2軟件包中的ANOVA過程進(jìn)行方差分析，多重比較用Duncan's法。

A：改革開放初期，力嘉從香港搬遷到深圳橫崗，逐漸從單一的紙品包裝業(yè)務(wù)擴(kuò)張到彩色印刷市場領(lǐng)域，較早享受到了國家對外資企業(yè)進(jìn)駐內(nèi)地投資所給予的各種優(yōu)惠政策。隨著改革開放進(jìn)程的不斷深化，內(nèi)地市場經(jīng)濟(jì)越發(fā)蓬勃，給包裝印刷帶來巨大的發(fā)展機(jī)遇，這些環(huán)境因素對力嘉的發(fā)展起到了重要的推動(dòng)作用，使力嘉迅速打開內(nèi)地市場，實(shí)現(xiàn)了從小到大以及到強(qiáng)的跨越。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例秸稈組合體外發(fā)酵指標(biāo)的綜合評定（見表2）

表2 不同比例秸稈組合體外發(fā)酵指標(biāo)的綜合指數(shù)評定

在精粗比為3∶7的日糧條件下，以蕎麥100%組為發(fā)酵參考組，對產(chǎn)氣量、pH值、干物質(zhì)消化率、揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮濃度、微生物蛋白、甲烷濃度進(jìn)行單項(xiàng)組合效應(yīng)和多項(xiàng)組合效應(yīng)綜合指數(shù)（MFAEI）評定。以SFAEI 評定時(shí)，VFA 以油菜20∶苜蓿80 組值最高，消化率以油菜40∶苜蓿60組最高，氨態(tài)氮以油菜20∶苜蓿80組最高，產(chǎn)氣量以蕎麥20∶青貯80組最高，pH 值以蕎麥20∶苜蓿80 組最高，MCP 以油菜20∶苜蓿80組最高。用MFAEI對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評定時(shí)發(fā)現(xiàn)，油菜20∶青貯80組合效應(yīng)值最高，蕎麥20∶苜蓿80組次之。

2.2 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)揮發(fā)性脂肪酸的影響（見表3）

在日糧精粗比3∶7 情況下，由表3 可知，揮發(fā)性脂肪酸的濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而有所增加。3 h對照組與試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組均差異極顯著（P＜0.01），與試驗(yàn)Ⅳ組無顯著差異（P＞0.05）；6 h對照組與各試驗(yàn)組均有極顯著的差異（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅵ組無顯著性差異（P＞0.05）；24 h對照組與試驗(yàn)組均有極顯著的差異（P＜0.01），12、24 h 試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅵ組無顯著性的差異（P＞0.05）。

表3 不同比例秸稈組合的體外培養(yǎng)VFA總濃度(mmol/l)

2.3 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)干物質(zhì)消化率影響（見表4）

在日糧精粗比3∶7情況下，由表4可見各試驗(yàn)組的干物質(zhì)消化率隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高。3 h對照組與試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組均差異不顯著（P＞0.05），與試驗(yàn)Ⅵ組差異顯著（P＜0.05），與試驗(yàn)Ⅴ組差異顯著（P＜0.05）；6 h對照組與試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組均差異不顯著（P＞0.05），與試驗(yàn)Ⅴ、Ⅵ組差異極顯著（P＜0.01）；12 h對照組與試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組、試驗(yàn)Ⅵ組均差異極顯著（P＜0.01），與試驗(yàn)Ⅴ組差異不顯著（P＞0.05）；24 h對照組與試驗(yàn)各組均差異極顯著（P＜0.01）。

表4 不同比例秸稈組合的體外培養(yǎng)干物質(zhì)消化率(%)

2.4 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響（見表5）

表5 不同比例秸稈組合的體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量(ml)

在日糧精粗比3∶7情況下，由表5可見，3 h對照組與試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），與試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異極顯著（P＜0.01）；6 h對照組與試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ組差異極顯著（P＜0.01），與試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅴ組差異不顯著（P＞0.05）；12 h對照組與試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異極顯著（P＜0.01），與試驗(yàn)Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05）；24 h 對照組與試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組均差異極顯著（P＜0.01），與試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)氨態(tài)氮濃度的影響（見表6）

表6 不同比例秸稈組合的體外培養(yǎng)氨態(tài)氮濃度的影響(mg/100 ml)

在日糧精粗比3∶7 情況下，由表6 可見，在試驗(yàn)開始3 h對照組與其它五組試驗(yàn)組均差異不顯著（P＞0.05）；6 h 對照組與試驗(yàn)Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組差異顯著（P＜0.05）；12 h 時(shí)，對照組與試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異極顯著（P＜0.01），；24 h 對照組與試驗(yàn)Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ組差異顯著（P＜0.05），與試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)甲烷排放量的影響（見圖1）

圖1 不同比例未處理秸稈組的體外培養(yǎng)甲烷排放量

在日糧精粗比3∶7 情況下，由圖1 可見，對經(jīng)過24 h的體外培養(yǎng)后產(chǎn)生的氣體進(jìn)行甲烷濃度的測定，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)Ⅲ組甲烷排放量最多，對照組較其它五組排放量都低，并且差異極顯著（P＜0.01）。甲烷排放量的順序依次為：試驗(yàn)Ⅲ組＞試驗(yàn)Ⅴ組＞試驗(yàn)Ⅳ組＞試驗(yàn)Ⅵ組＞試驗(yàn)Ⅱ組＞試驗(yàn)Ⅰ組。

2.7 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)微生物蛋白含量的影響（見表7）

表7 不同比例秸稈組合的體外培養(yǎng)微生物蛋白含量(mg/100 ml)

在日糧精粗比3∶7 情況下，各試驗(yàn)組微生物蛋白含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長呈下降趨勢。試驗(yàn)在3 h直到試驗(yàn)結(jié)束24 h 對照組與試驗(yàn)組均差異極顯著（P＜0.01）。在24 h試驗(yàn)Ⅱ組微生物蛋白含量最高，順序依次為：試驗(yàn)Ⅱ組＞試驗(yàn)Ⅲ組＞試驗(yàn)Ⅳ組＞對照組＞試驗(yàn)Ⅵ組＞試驗(yàn)Ⅴ組。

2.8 不同比例秸稈組合對體外培養(yǎng)pH值的影響（見表8）

表8 不同比例秸稈組合的體外培養(yǎng)pH值

3 討論

通過對不同飼料進(jìn)行組合，可以提高單個(gè)飼料的消化率，組合后的飼料其能量和蛋白利用率也會(huì)有所改變。如果不考慮飼料間的互作效應(yīng)，將會(huì)導(dǎo)致對日糧營養(yǎng)價(jià)值評估的不準(zhǔn)確[9]。飼料組合后指標(biāo)較復(fù)雜，如果只考慮其中一種或幾種指標(biāo)很難達(dá)到準(zhǔn)確的權(quán)衡。因此組合效應(yīng)的綜合指數(shù)就解決了這個(gè)難題。王旭（2003）[10]在2003年運(yùn)用體外法研究了粗飼料混合后的組合效應(yīng)，并且首次用多項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（MFAEI）進(jìn)行研究。于騰飛等（2012）[11]利用體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)對花生蔓與其他粗飼料之間組合效應(yīng)進(jìn)行研究，得出了與花生蔓產(chǎn)生最優(yōu)組合的粗飼料及最佳搭配比例。本試驗(yàn)采用人工模擬瘤胃發(fā)酵體外培養(yǎng)法，并采用多項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（MFAEI）評估蕎麥秸稈、油菜秸稈與苜蓿干草、青貯玉米間的組合效應(yīng)。

瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸是碳水化合物經(jīng)過微生物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，是衡量瘤胃內(nèi)微生物活性的主要指標(biāo)，更是反芻動(dòng)物生存、生長、泌乳、繁殖的重要能源[12]。當(dāng)瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸提高時(shí)，可以間接的說明瘤胃內(nèi)的消化率提高，瘤胃的發(fā)酵效果較好[13]。本試驗(yàn)中揮發(fā)性脂肪酸的含量隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的增長均呈上升的趨勢。

消化率是評定飼料組合效應(yīng)的重要指標(biāo)，飼料組合后的表觀消化率不等于各單一飼料消化率的總和，因此也就有了組合效應(yīng)[14]。夏科等（2012）[15]通過對粗飼料組合效應(yīng)中能量、消化率指標(biāo)的研究，得出了飼料間可以產(chǎn)生正組合效應(yīng)的飼料組合，提高了飼料的消化率。本試驗(yàn)中試驗(yàn)Ⅰ組24 h 消化率達(dá)到了37.19%，其組合效應(yīng)綜合指數(shù)也最高.

瘤胃內(nèi)微生物作用會(huì)產(chǎn)生氣體，微生物活力越高，產(chǎn)氣量越大，發(fā)酵程度也就越好。本試驗(yàn)中對照組的產(chǎn)氣量最高，達(dá)到了532 ml，同時(shí)對照組的消化率也較其它試驗(yàn)組高，證明產(chǎn)氣量和消化率是呈高度正相關(guān)的，這與Blummel 等(1997)[16]的研究是一致的。唐賽勇(2009)[17]通過對玉米青貯和稻秸之間進(jìn)行組合效應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)瘤胃干物質(zhì)降解率和產(chǎn)氣量的組合效應(yīng)排序是一致的。本試驗(yàn)中，24 h的干物質(zhì)消化率大小的順序?yàn)閷φ战M＞試驗(yàn)Ⅱ組＞試驗(yàn)Ⅲ組＞試驗(yàn)Ⅴ組＞試驗(yàn)Ⅵ組＞試驗(yàn)Ⅳ組，24 h的產(chǎn)氣量的順序?yàn)閷φ战M＞試驗(yàn)Ⅱ組＞試驗(yàn)Ⅲ組＞試驗(yàn)Ⅴ組＞試驗(yàn)Ⅵ組＞試驗(yàn)Ⅳ組，同干物質(zhì)消化率的排序也是一致的。

瘤胃NH3-N 是綜合反映反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要參數(shù)。瘤胃內(nèi)NH3-N 含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，被降解后產(chǎn)生NH3-N，產(chǎn)生的NH3-N 可以與酮酸合成微生物蛋白質(zhì)，而大多數(shù)情況下飼料降解產(chǎn)NH3-N 的速率遠(yuǎn)超過利用NH3-N 的速率。本試驗(yàn)NH3-N濃度并無規(guī)律性變化，試驗(yàn)經(jīng)過24 h發(fā)酵后其NH3-N濃度均呈正組合效應(yīng)，說明試驗(yàn)的組合日糧有利于蛋白的分解。

甲烷的產(chǎn)氣量多少可以在一定程度上反映出能量的消化率[18]。趙麗媛等（2014）[19]通過研究添加商業(yè)外源性纖維分解酶制劑及其組合對玉米秸稈體外發(fā)酵和甲烷生成的影響，發(fā)現(xiàn)這種方法可以降低甲烷的排放量。本試驗(yàn)中對照組甲烷排放量最低，組合效應(yīng)綜合指數(shù)最高。

瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)的濃度是檢測微生物對NH3-N 的利用率的重要指標(biāo)[20]。微生物生長的過程中能量和蛋白質(zhì)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，動(dòng)物機(jī)體中能氮比例適中，可以提高瘤胃微生物合成微生物蛋白的效率[21]。試驗(yàn)Ⅱ組中苜蓿占80%，苜蓿中蛋白含量較高補(bǔ)充了蕎麥秸稈蛋白含量低的缺點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示24 h 的試驗(yàn)Ⅱ組的微生物蛋白濃度最高。本試驗(yàn)各試驗(yàn)組微生物蛋白含量均差異極顯著，這也可以更直觀的表現(xiàn)出飼料之間組合效應(yīng)差異[22]。

本試驗(yàn)經(jīng)過人工瘤胃發(fā)酵處理后的飼料組合pH值維持在5.57～5.93 的正常范圍內(nèi)，表明模擬瘤胃裝置是正常的。維持正常的pH 值是瘤胃發(fā)酵的前提。本試驗(yàn)從開始到結(jié)束，各試驗(yàn)組pH值均差異不顯著。

4 結(jié)論

通過對蕎麥秸稈、油菜秸稈、苜蓿干草、青貯玉米6種不同比例的組合，進(jìn)行體外培養(yǎng)和綜合評定發(fā)現(xiàn)，油菜20∶青貯80 組合效應(yīng)值最高，蕎麥20∶苜蓿80組次之。