NtCycB2基因表達對煙草腺毛發生的影響

孟盈，閆筱筱，王召軍，張洪映，楊欣玲，楊永鋒，崔紅*

1 河南農業大學，煙草學院，鄭州市文化路95號 450002；

2 河南中煙工業有限責任公司，鄭州市隴海東路72號 450000

煙草植株的氣生部分密被腺毛，對植株抗性和煙葉質量具有重要影響[1]。栽培煙草的腺毛主要由三種類型混合組成。其中，長柄分泌型腺毛為主要類型，是二萜和糖脂合成的重要場所，二者不僅是重要香氣前體物質[2]，對蚜蟲抗性也有較大影響[3]。短柄分泌型腺毛是葉面抗性蛋白的合成場所，在抑制孢子萌發和抵抗真菌侵染中起重要作用[4]。構成了煙株與環境間的物理屏障，可以有效地防御各種非生物脅迫及生物脅迫[5]。因此，提高腺毛密度是煙草品質和抗性改良的重要途徑之一，而這依賴于對煙草腺毛形態發生分子機制的全面解析。

雖然，擬南芥單細胞腺毛發生分子機制研究已取得了突破性進展，但多細胞腺毛與單細胞腺毛在發生調控機制上有并不相同[6-8]。細胞周期蛋白（Cyclins）在真核細胞分裂過程中起調控作用，對細胞增殖及植物發育有重要意義[9]。Cyclins共有A、B、C、D、H、L、T、U、SDS和J18-type 10個家族，功能各不相同[10]。其中，B-型細胞周期蛋白（B-type cyclins）控制核內復制（G2）期轉向分裂（M）期的轉換[11]，過量表達CycB2的水稻能促進細胞分裂，加快水稻根系的生長，與CDKB2相互作用后調節水稻根系的生長發育[12]；在種子發育過程中也可以發揮作用，玉米CycB2與CDKA相互作用后，共同參與調控胚乳發育過程中的細胞周期[13]；對腺毛發生也有影響，CycB1;2在GL2啟動子控制下在擬南芥腺毛中表達，可使單細胞腺毛轉變為叢生的多細胞型腺毛[14]。SlCycB2是從番茄wooly突變體中發現的B型細胞周期蛋白基因，當SlCycB2的表達受到抑制時，非分泌型腺毛（III和V型）明顯增多，分泌型腺毛（I和IV型）消失；當SlCycB2過表達時，非分泌型腺毛及分泌型腺毛都明顯減少[15-16]。這反映出多細胞腺毛發生調控機制的精細和復雜性，也說明B型細胞周期蛋白在多細胞腺毛發生調控網絡中具有舉足輕重的地位。

煙草腺毛密度受到多種栽培因素[17-23]與環境因子[24-27]的影響，但其遺傳調控機制還不清晰。雖然有研究表明NtCycB2在煙草中的過表達及在番茄中異源表達都出現抑制腺毛發生的現象[16]，但該基因在煙草中的表達模式及對不同類型腺毛發生的調控模式并未報道。為此，本研究采用RT-PCR技術，進行煙草K326 NtCycB2克隆和生物信息學分析，分別構建過表達載體和基因編輯載體進行遺傳轉化分析，通過腺毛形態的比較研究解析了，深入解析NtCycB2表達對煙草腺毛形態發生的調控作用，旨在為煙草葉面化學分子定向改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料煙草K326無菌苗培養于光照培養箱，培養溫度為25℃、濕度為60%，光照條件為16 h光/8 h暗。

1.2 基因克隆和序列分析

利用Primer Primer 5.0軟件設計NtCycB2克隆引 物（F1：ATGAGCCGAAGAAATGGAAAT，R1：CTAACTGATATTCCTCCTAGTAG）和高保真Pfu酶進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C 10min；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35次 循 環；72°C 10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用天根公司DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收產物連接到pMD19-T載體，轉化Escherichia coli DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，酶切鑒定后送深圳華大公司進行測序驗證。

根據茄科基因組網站（https://solgenomics.net/）、中國煙草基因組數據庫（V3.0）和擬南芥TAIR網站（https://www.arabidopsis.org）獲取相關CycB2基因的序列。利用Prosite數據庫（https://www.expasy.org/tools/）分析蛋白質的理化性質，使用ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam/）預測氨基酸分子量。利用Clustal Omega program（https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/）和MEGA5.0軟件進行進化和多序列比對分析。利用NCBI Conserved Domain Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析CycB2基因的保守結構域。

1.3 基因表達模式分析

選擇五葉期生長一致的幼苗進行非生物脅迫處理：100μmol·L-1MeJA溶液進行外源激素處理，150mmol·L-1NaCl溶液進行高鹽脅迫，20% PEG6000溶液進行滲透脅迫，4℃進行低溫脅迫和42℃進行高溫脅迫。分別在脅迫處理0、1、6、12和24h進行樣品收集，經液氮速凍后保存于-80℃。Trozol法提取RNA。反轉錄程序參照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書進行。

以煙草L25核糖體蛋白（L18908）（F2：GCTTTCTT CGTCCCATCA，R2：CCCCAAGTACCCTCG TAT）為內參[28]，按照Invitrogen公司的2×RealStar Green Fast Mixture（SYBR Green）試劑盒說明書，利用F1/R1引物進行實時定量RT-PCR。20 μL反應體系：SYBR Green Mix 10.0 μL，上、下游引物（10.0 μmol L-1）各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNasefree H2O 8.0 μL。反應條件為95°C 10 min；95°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，40次 循 環；在72°C延伸步驟收集熒光信號，溶解曲線為：95°C，15s。采用2-△△Ct法[29]進行誤差分析。

1.4 載體構建

利用NtCycB2克隆引物（F3：CGGGATCCATG AGCCGAAGAAATGGAAAT，R3：CGGAATTCC TAACTGATATTCCTCCTAGTAG，下劃線標注的酶切位點分別是BamHI和EcoRI）進行PCR擴增。將測序正確的目的基因連接到過表達載體構成pCXSNFLAG-NtCycB2。

根據測序得到的NtCycB2的CDS序列，首先設計并合成gRNA靶位點序列（Targeting Sequence：GATCAACCACCCACAAGTGG，下劃線標注的是Protospacer Adjacent Motifs，即PAM區），并添加BsaI酶切位點。Oligo二聚體與CRISPR/Cas9載體進行連接：CRISPR/Cas9載體2.0μL，Oligo二聚體1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，無菌水H2O補充至10.0 μL。最后將連接產物轉化至農桿菌中構成NtCycB2-knock out基因編輯載體（圖1）。

圖1 NtCycB2基因敲除載體結構Fig.1 Vector structure of NtCycB2-knock out

1.5 煙草遺傳轉化與鑒定

煙草轉基因采用葉盤轉化法[30]。NtCycB2過表達載體和基因敲除載體轉化后將葉片組織轉移到含有潮霉素（60.0 mg·L-1）的分化培養基上進行分化培養和抗性篩選。獲得的敲除表達抗性株系進行靶位點附近序列的測序分析，通過檢測靶位點堿基突變情況確定敲除株系。

利用F1/R1引物對過表達抗性株系進行RT-PCR檢測分析，方法同1.3。

1.6 腺毛形態觀察

葉片腺毛組織化學染色法參考Lin和Wagner的方法[31]。將葉片在0.2%（w/v）羅丹明B水溶液中浸染30min，用蒸餾水漂洗三次，使用無菌濾紙吸干表面水分后，利用超景深顯微鏡（基恩士VHR-5000，日本）對葉片表面進行觀察，并在上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛密度統計分析。

1.7 數據處理和統計方法

所有數據使用EXCEL進行整理，應用SPSS17.0軟件（IBM，美國）進行顯著性分析，數據處理采用單因子方差（One-way ANOVA）分析。

2 結果與分析

2.1 NtCycB2基因克隆及生物信息學分析

以K326的DNA為模板，利用NtCycB2克隆引物進行PCR擴增后，結果如圖2所示。經測序發現該基因編碼區長333bp，共兩個拷貝，NtCycB2-1、NtCycB2-2核苷酸同源性達94%，氨基酸相似性100%。編碼110個氨基酸，分子量為12.2kD，理論等電點為8.60，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數為11，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數為14，其分子式為C509H847N153O169S11。

圖2 煙草NtCycB2基因克隆Fig.2 PCR amplification of NtCycB2

圖3 NtCycB2蛋白與近源物種同源蛋白的多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of NtCycB2 protein and relative species homolog protein

NCBI網站在線分析CycB2基因具有三個典型的Motifs：I、II和III（圖3），其中，Motifi和II構成WD40結構域，MotifiII構成RING-Like結構域。蛋白序列比對分析結果表明K326 NtCycB2蛋白序列與其親本絨毛煙草（NtomCycB2：Ntom_KB972106.1）和林煙草（NsylCycB2：Nsyl_KD960057.1）的蛋白序列相同，與香料煙巴斯瑪（BXCycB2：Ntab-BX_AWOK-SS231466）、白 肋 煙TN90（TN90CycB2：Ntab-TN90_AYMY-SS4464）和紅花大金元（HDCycB2：Ntab0642370.1）的蛋白序列也相同；而與本氏煙（NbCycB2-1：Niben101Scf10299g00003.1和NbCycB2-2：Niben101Scf10396g00002.1）蛋 白序列的同源性均為96.36%，與番茄（SlCycB2：Solyc10g083140）、擬南芥（AtCycB2：AT5G06270和AtCycB3：AT3G11600）蛋白序列的同源性分別為71.05%、52.38%、和51.20%。系統進化樹分析結果也表明，CycB2在栽培煙草不同類型、不同品種及其親本之間高度保守，但與本氏煙NbCycB2存在較大差異，與番茄SlCycB2及擬南芥AtCycB2的親緣關系較遠（圖4）。

圖4 CycB2蛋白的系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CycB2 protein

2.2 NtCycB2基因表達模式分析

為研究NtCycB2的組織表達特性，分別對煙草根、莖、葉、去腺毛葉、花和腺毛中NtCycB2表達水平進行RT-PCR檢測分析，結果如圖5A所示。腺毛和花中NtCycB2的表達水平最高，分別是根的7.6倍和5.2倍。NtCycB2表達水平在根和莖中較低，在葉片中相對較高，但在去腺毛葉片中明顯降低。由此推測，NtCycB2主要在煙草腺毛中富集表達，這與SlCycB2在番茄腺毛中特異表達相一致。

圖5 NtCycB2基因表達模式分析Fig.5 Response of NtCycB2 to different stress treatments

為研究NtCycB2對逆境的應答模式，采用RTPCR技術，分析了水分、鹽、溫度、MeJA等脅迫條件下葉片NtCycB2表達水平的變化規律。在PEG和NaCl處理下，NtCycB2表達水平隨處理時間延長而逐漸降低（圖5-B，C），表明干旱和鹽脅迫對NtCycB2表達具有一定的抑制作用。在高溫處理下，NtCycB2表達水平隨處理時間延長而逐漸升高，而在低溫處理下顯示出明顯降低的趨勢，說明溫度對NtCycB2表達具有一定的誘導作用。在MeJA處理12h時NtCycB2表達量陡升，在24h時又明顯降低，表明了MeJA對NtCycB2表達的調控具有一定的時間效應。

2.3 遺傳轉化與篩選鑒定

2.3.1 NtCycB2基因敲除

采用農桿菌介導法將NtCycB2-knockout表達載體轉化K326，對獲得的潮霉素抗性苗進行PCR擴增和測序，在所檢測的40株抗性苗中，有19株在靶位點序列檢測到了雙峰現象，編輯效率接近50%。在T1代中篩選中，獲得了4個在靶位點序列發生了插入或缺失突變的純合突變體。如圖6顯示，NtCycB2-ko-2的序列中第76堿基位置后出現C插入；NtCycB2-ko-3的序列中第73堿基位置的CCA缺失，第76堿基位置后出現C插入；NtCycB2-ko-15的序列中第73堿基位置的CCAC缺失；NtCycB2-ko-16第76堿基位置后出T插入。這些插入和缺失最終都導致了NtCycB2翻譯的終止。

圖6 NtCycB2基因敲除株系中NtCycB2序列分析Fig.6 Sequence analysis of NtCycB2 among different NtCycB2-knockout lines

2.3.2 NtCycB2基因過表達

采用農桿菌介導法將pCXSN-FLAG-NtCycB2表達載體轉化K326，并對抗性芽/幼苗進行潮霉素抗性篩選。采用RT-PCR技術對該植株（NtCycB2-OE-1）和4個基因敲除株系（NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16）的純合突變體進行NtCycB2表達水平分析，結果如圖7所示。NtCycB2-OE-1植株中NtCycB2的表達量明顯較高，是對照K326的3.1倍。而四個敲除株系中NtCycB2表達量與對照相近，表明其在轉錄水平并無明顯變化。

2.4 NtCycB2轉基因植株腺毛形態觀察和腺毛密度分析

對NtCycB2敲除和過表達株系幼苗進行了形態學觀察，結果如圖8所示，NtCycB2-ko-2植株形態與對照相似，但莖和葉上的腺毛更為濃密，整個植株呈現多毛狀態（圖8B）。NtCycB2-OE-1植株與對照形態有所不同，不僅葉片和莖表面光滑少毛，而且葉面光亮、葉片卷曲，形狀不規則（圖8C）。

經羅丹明染色后對不同株系的腺毛進行觀察，圖8-D、E和F顯示了NtCycB2表達對莖部腺毛發生的影響。與對照相比，NtCycB2-ko-2莖上腺毛濃密，腺柄較長，腺頭較為飽滿；而NtCycB2-OE-1莖表十分光滑，長柄腺毛幾乎消失，僅觀察到少量的短柄分泌型腺毛。圖8-G、H和I顯示了NtCycB2表達對葉面腺毛發生的影響。與對照相比，NtCycB2-ko植株葉面的腺毛數量顯著增加，大部分為長柄分泌型腺毛，腺頭著色較深，表明其物質代謝和分泌功能旺盛；而NtCycB2-OE-1葉面分泌型腺毛和非分泌型腺毛數量明顯減少，僅有少量的短柄分泌型腺毛存留。

圖8 NtCycB2基因敲除和過表達株系的腺毛分析（150×）Fig.8 Trichome analysis of NtCycB2 knock-out lines and overexpression line（150×）

分別取NtCycB2敲除株系和過表達株系的幼葉進行上表皮腺毛密度統計分析，結果如圖9所示。4個NtCycB2敲 除 株 系NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16植株的葉面腺毛總數顯著高于對照。其中，長柄型或短柄型的分泌型腺毛的密度都顯著增加，而非分泌型腺毛的密度則沒有明顯改變。NtCycB2-OE-1株系中分泌型腺毛和非分泌型腺毛數量均顯著減少，且均呈現顯著性差異。該結果表明，NtCycB2對煙草腺毛發生尤其是分泌型腺毛的發生，具有明顯的負向調控作用。

圖9 NtCycB2敲除和過表達株系的葉面腺毛密度統計Fig.9 Statistics of trichome density of leaf surface of NtCycB2 knock-out line and over-expression line

3 討論和結論

植物腺毛作為表皮細胞的特化結構，在植物抵御環境脅迫[32]和次生代謝產物積累[33]等方面發揮重要作用。煙草腺毛由多種分泌型和非分泌型腺毛混合組成，既形成了煙株與外界的物理屏障和化學屏障，同時又是重要的香氣前體物質合成場所。因此，提高煙草腺毛密度是煙草的重要目標。但栽培煙草遺傳背景狹窄、腺毛密度變異較小[34]，常規的雜交育種難以有所突破。而利用關鍵基因的表達調控進行分子改良，是煙草腺毛密度改良的主要途徑。

模式植物擬南芥為代表的單細胞腺毛發生已被逐步解析[35]，但多細胞腺毛發生的分子機制還不清楚。最近研究發現番茄多細胞腺毛發生受到B型周期蛋白的調控，為煙草腺毛分子改良提供了理想的靶點。因此，本文克隆并分析了K326的B型周期蛋白NtCycB2。雖然NtCycB2氨基酸序列在栽培煙草不同類型和不同品種中高度保守，但與番茄SlCycB2相似性僅71.05%，預示二者之間的功能同中存異。為闡明NtCycB2在煙草腺毛發生中的調控作用，分別對該基因進行了過表達和敲除表達研究。形態觀察發現，NtCycB2過表達植株莖和葉光滑少毛，葉片上除了少量短柄分泌型腺毛外，長柄分泌型和非分泌型腺毛基本消失；而NtCycB2敲除植株中莖葉呈現多毛現象，分泌型腺毛密度顯著增加，而非分泌型腺毛無明顯變化。該結果證明，NtCycB2對煙草分泌型腺毛具有顯著的負調控作用，這與番茄的研究結果有所不同。番茄共有7種類型的腺毛，包括4種分泌型（I、IV、VI與VII）和3種非分泌型（II、III和V）[36]。SlCycB2對III和V型非分泌型腺毛具有明顯的負調控作用，SlCycB2過表達和抑制都會導致I型腺毛的完全消失，對于其它類型腺毛發生無明顯影響[16]。B型細胞周期蛋白在煙草和番茄中都具有調控腺毛發生的功能，但調控模式存在明顯差異，其中原因并不清楚。這充分說明了多細胞腺毛發生調控機制的復雜性，其不僅具有物種特異性，也具有腺毛類型的特異性。而NtCycB2對煙草分泌型腺毛顯著的負調控作用，預示其在煙草葉面化學定向改良中具有較大的應用潛力。其一，該基因的靶標-長柄分泌型腺毛是葉面化學物質合成的重要場所；其二，該基因的負向調控模式有利于基因編輯技術的應用，而基因編輯技術改良品種無疑具有較大的公眾接受性和應用空間。

當然，在此之前還應充分評估NtCycB2表達對煙草生長發育的影響。NtCycB2表達模式分析發現，該基因主要在腺毛和花中高表達，這與SlCycB2相一致，預示其主要影響植物的腺毛和花器的發育過程。SlCycB2過表達導致了胚胎發育受阻和不育[37]，NtCycB2過表達使煙苗形態出現了異常，說明其過表達對植物生長發育和生殖有一定負作用。但到目前為止，還沒有關于CycB2敲除影響植株生長發育的報道。在本研究中，NtCycB2敲除后，煙苗腺毛濃密，發育正常，生長旺盛，預示其在生產中具有較好的應用潛力。當然，下一步但還需要進行田間比較試驗，以闡明NtCycB2敲除對煙株農藝性狀、葉面化學、煙葉質量及其可用性的重要影響，為煙草葉面化學的定向改良奠定基礎。