煙草NtSAP5基因克隆及干旱脅迫下的功能鑒定

白戈，楊大海，姚恒，謝賀

云南省煙草農業(yè)科學研究院，育種與生物技術研究中心，云南昆明圓通街33號 650021

外界環(huán)境條件能夠顯著地影響植物的生長和發(fā)育，植物為了能夠適應外界逆境條件，進化出了復雜的生理及分子響應機制[1-3]。已發(fā)現多種植物基因參與到植物抗逆過程，如bHLH蛋白、NAC蛋白、AP2/EREBP等轉錄因子尤為重要[2,4-5]。其中一類轉錄因子Stress Associated protein （SAP）基因家族在調控植物抗逆過程中非常重要。該基因家族的大多數基因具有兩個鋅指基序，在N端具有一個A20結構域，在C端具有一個AN1鋅指結構域[6]。

水稻的OSISAP1及OSISAP8基因能夠被諸如冷、脫水、鹽、重金屬、傷害及ABA等多種逆境條件誘導，在水稻中過表達OSISAP1能夠誘導WRKY76、OsRCI2-5等抗逆基因表達并提高水稻抗旱能力[7]。在煙草中過表達OSISAP1及OSISAP8基因會提高煙草的耐冷性、耐旱性、耐鹽性[6,8]。水稻已鑒定出一組A20/AN1類型的鋅指蛋白，包括ZFP177、ZFP181、 ZFP176、ZFP173、ZFP181、ZFP176及ZFP157，這些基因能夠被冷、干旱及雙氧水脅迫誘導。在煙草中過表達ZFP177能夠提高煙草對高溫及低溫的抗性，但該轉基因煙草對干旱及鹽脅迫更敏感[9]。在擬南芥中過表達擬南芥內源AtSAP5基因能夠顯著的提高擬南芥的抗旱性，該基因所對應的T-DNA插入突變體則對干旱脅迫表現敏感[10]。SAP類鋅指蛋白在植物干旱等逆境中發(fā)揮功能，其部分成員的抗旱功能在擬南芥、水稻等多個物種中得到了驗證，但在茄科物種中物種自身的SAP類基因在干旱條件下的作用研究較少。本文克隆了煙草中NtSAP5基因并對該基因的組織特異表達及干旱條件下的轉錄水平進行檢測，對過表達后的抗旱表型進行分析，為研究煙草對干旱響應及抗旱分子機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料、種植條件及干旱脅迫處理

用于基因表達分析的煙草栽培品種K326，種子由云南省煙草農業(yè)科學研究院保存。K326種子在花盆中萌發(fā)，在16小時光照、28℃，8小時黑暗、23℃培養(yǎng)箱內生長。

本文采用了2種干旱處理條件：一是6～7葉煙草幼苗，移出花盆，清水漂去根部的培養(yǎng)基質，用濾紙吸干根部水分；然后將煙草植株整體在空氣中干燥，在處理的0 h、0.5 h、1 h取葉片樣品，方法詳見文獻[7]；二是6～7葉時煙草幼苗停止?jié)菜?天，觀察抗旱表型。取樣樣本液氮速凍，保存于-80℃中用于RNA提取。

1.2 煙草RNA提取與cDNA制備

采用Qiagen RNeasy mini plant kit（Cat 74104 ）提取煙草的RNA。在冰上準備10 μL的反轉錄反應體系，包括2 μg總RNA、1 μL的50 μM oligo（dT）和1 μL的10 mM dNTP和適量經DEPC處理過的水，將該體系在65℃溫浴5 min后，迅速置于冰上1 min。

將上述體系中加入2 μL的10× RT Buffer、4 μL的25 mM MgCl2、2 μL的0.1 M DTT、1 μL的RNaseOUT（40 U/μL）和1 μL的SuperScript III RT（200 U/μL）后，在50℃下保持50 min，并在85℃下使酶失活、在冰上冷卻終止反應，即獲得cDNA。

1.3 基因克隆

根據中國煙草基因組數據庫基因ID Ntab0877490設計引物，采用PCR方法克隆獲得候選基因片段，PCR擴增的詳細步驟及注意事項請參考《分子克隆實驗指南（上冊）》。克隆上游引物NtSAP5-F：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC ATGGCTCAGAGAACAGAGAAAG-3',下游克隆引NtSAP5-R：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAG CTGGGTCTCAAAGTTTAACGATCTTCG -3'。（標下劃線部分為gateway接頭序列，用來發(fā)生重組反應將序列導入到pDONR-Zeo載體中）根據gateway BP反應將擴增獲得到的片段通過重組反應導入到pDONR-Zeo載體中。然后將含有NtSAP5序列的pDONR-Zeo通過LR反應導入到gateway過表達載體pB2GW7中。

1.4 植物轉基因

將含有NtSAP5片段的pB2GW7載體通過凍融法轉化到農桿菌LBA4404中。然后采用葉盤法轉化煙草品種K326。通過Basta抗生素篩選獲得具有NtSAP5基因的過表達材料。

1.5 實時定量PCR

反應體系為20 μL，包括 10 μL 的2× SYBR buffer，1 μL的cDNA，正向、反向引物各1 μL，7 μL的水。反應程序為：94℃，1 min；94℃，30 sec，58℃，30 sec，40個循環(huán)；72℃，5 min。

所有qRT-PCR進行三次重復，以煙草內源26s核糖體 RNA基因為內參。內參引物：26S-F 5' -GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'；26S-R，5'- TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'。基因特異引物：NtSAP5-qRT-F，5'-CCAAGGTCGCATATCCTCAT-3'；NtSAP5-qRT-R，5'-GCCGGTTAATCCTAGCTTCC-3'。2-ΔΔCT方法計算倍數變化，三次生物學重復計算±SD，Error bars為±SD（n = 3）。

2 結果與分析

2.1 NtSAP5序列信息

在中國煙草基因組數據庫中查找到該基因ID為Ntab0877490.1，該基因與擬南芥中AtSAP5基因最為同源，因此將該基因命名為NtSAP5。設計特異引物通過克隆獲得NtSAP5的CDS編碼區(qū)，該片段大小為500 bp左右。通過測序發(fā)現煙草NtSAP5基因的CDS序列為474個堿基，編碼281個氨基酸，NtSAP5蛋白分子量為17513.94，等電點為9.5070。將其編碼CDS序列與基因區(qū)間序列比對，NtSAP5基因沒有內含子。在NCBI網站上通過Blasp比對發(fā)現NtSAP5蛋白與絨毛煙草一個蛋白（NCBI登錄號為 XP_009631181）最為相似，氨基酸同源性達到97%。其次NtSAP5與栽培煙草中的一個蛋白（中國煙草基因組數據庫基因ID為Ntab0779290）最為相似，氨基酸同源性達到93%。除了這兩個基因，NtSAP5與茄科番茄、馬鈴薯中的同源基因編碼蛋白的同源性較高，與水稻OSISAP1蛋白同源性較低，僅為60%。

分析NtSAP5蛋白的結構域，發(fā)現NtSAP5蛋白的N端與C端，在21-45、97-134氨基酸范圍內分別編碼一個A20與AN1結構域（圖1），該結構域為一個鋅指蛋白結構域，具有結合DNA的功能。

圖1 .NtSAP5蛋白結構域注釋Fig.1 Functional domain annotation of NtSAP5

2.2 NtSAP5基因各煙草組織表達量及干旱誘導表達量

采用RT-PCR方法檢測NtSAP5基因在煙草根、葉片、莖、花、幼莢中的表達量，結果顯示，NtSAP5基因在煙草根中優(yōu)勢表達，在莖和葉中表達量較少，在花中表達量最低（圖2A）。干旱脅迫下的RT-PCR結果表明，NtSAP5基因在干旱脅迫處理1小時，2小時的時候表達量上調，而在干旱脅迫處理2小時后表達量下調（圖2B），圖2B的干旱脅迫方法采用的是空氣干燥脫水處理[7]，與采用停止?jié)菜幚砀珊禇l件下的基因表達結果趨勢一致，結果未附。

提取栽培煙草K326的RNA通過反轉錄獲得cDNA，采用特異引物克隆獲得NtSAP5基因的CDS片段，獲得500 bp左右的目的片段，片段大小符合預期。將該片段的測序結果在中國煙草基因組數據庫中進行Blastn比對，結果表明擴增序列與目的序列完全相同。將擴增得到的目的片段通過BP反應克隆到gateway pDONR-Zeo載體中。然后將在pDONR-Zeo載體中的目的片段經過LR反應克隆到gateway過表達載體pG2BW7中。將構建好的載體通過農桿菌轉化煙草，通過抗生素篩選獲得陽性轉基因植株。

采樣并提取轉基因陽性植株及非轉基因植株的RNA，經過反轉錄獲得cDNA，采用real-time PCR檢測基因的轉基因植株NtSAP15的表達量。收取表達量顯著增高的兩個轉基因植株的T0代種子，其中OE_1植株的NtSAP15的表達量比非轉基因植株表達量增加5倍，OE_2植株的NtSAP15的表達量比非轉基因植株標量上調27倍（圖3）。

圖2 NtSAP5基因煙草中各組織表達量及干旱脅迫表達量Fig.2 Expression of NtSAP5 gene in tobacco tissues and under drought stress

圖3 NtSAP5過表達植株基因表達量Fig.3 Transcript-level expression analysis of two NtSAP5 overexpression lines

將兩個獨立的轉基因T0代種子播種，分單株收獲T1代植株種子。將從不同T1轉基因株系收獲的種子播種在濃度為20mg/L的Basta平板上，挑選出萌發(fā)后存活超過98%的轉基因株系為轉基因純合株系。選取并種植純合轉基因株系及非轉基因煙草植株，待植株長到6-7葉期時，停止?jié)菜珊得{迫處理，干旱處理7天。圖4 為干旱脅迫處理7天NtSAP5過表達煙株與未轉基因煙株表型，包括干旱脅迫處理過表達轉基因植株OE_1、干旱脅迫處理過表達轉基因植株OE_2、干旱處理非轉基因煙草植株，其中OE_1、OE_2及非轉基因植株各選3株植株。結果表明經過七天的干旱處理，過表達NtSAP5基因的煙草植株與非轉基因植株相比具有明顯的耐旱性，非轉基因植株表現出明顯的干枯表型，而兩個獨立的NtSAP5轉基因株系葉片較為挺拔，尤其是OE_2轉基因株系表現更強的耐旱性，這與OE_2株系中更高的NtSAP5表達量相吻合。

圖4 NtSAP5轉基因植株的抗旱表型Fig.4 Drought resistance phenotype of NtSAP5 transgenic lines

3 討論與結論

本研究通過同源克隆獲得了煙草中SAP5同源基因，將該基因命名為NtSAP5。通過克隆獲得栽培煙草NtSAP5序列，該基因CDS區(qū)域長度為474 bp，蛋白編碼長度為278 aa。NtSAP5基因沒有內含子，其編碼蛋白在N端具有一個A20結構域，在C端具有一個N1結構域，這兩個結構域都是較為保守的鋅指結構域，根據兩個鋅指結構域的存在，可推斷該基因具有結合DNA的功能。水稻OSISAP1沒有已知的核定位信號，但定位在細胞核中[11]，擬南芥AtSAP5具有一個核定位信號且定位在細胞核內。水稻OSISAP1能夠通過A20鋅指結構域與其它SAP成員如RLCK253相結合[10]。NtSAP5與水稻的同源基因類似，沒有已知的核定位信號結構域（NLS），NtSAP5可能通過與其它轉錄因子結合被招募進細胞核內，同時也不能排除存在未知的核定位信號進入細胞核的可能性。

轉錄因子是植物逆境應答信號通路早期信號轉導的重要成員。轉錄因子OSISAP1在水稻干旱脅迫下表達量先上升后下降，表明其在干旱的早期應答中發(fā)揮作用[12]。在本研究中，NtSAP5的干旱應答變化也出現先上升，而后緩慢下降，提示在NtSAP5同樣在煙草抗旱的早期反應中行使功能。NtSAP5在根與葉片中表達量較高，在花與幼莢中表達量低，表明該基因在煙草的營養(yǎng)生長器官及營養(yǎng)生長階段行使功能，該基因在根中的高量表達，提示該基因可能在在根對干旱響應中發(fā)揮作用，具體情況需要進一步的實驗驗證。

NtSAP5在栽培煙草K326中的過表達轉基因純合株系在干旱脅迫處理下，與對照相比具有明顯的耐旱性。這些結果驗證了該基因在煙草抗旱的生理過程中發(fā)揮功能。NtSAP5基因在擬南芥中的AtSAP5同源基因及水稻中的OSISAP1同源基因均能提高植物對干旱的抗性，但在茄科作物中，對該類基因的研究較少， NtSAP5基因增強煙草抗旱能力的結果，對SAP5等鋅指蛋白基因在茄科作物中功能的研究提供了初步的證據。

本研究從煙草中克隆到一個鋅指蛋白基因，命名為NtSAP5基因，其具有保守的A20與N1鋅指蛋白結構域。NtSAP5基因在茄科的番茄及馬鈴薯中具有相應同源基因且同源性較高，在雙子葉擬南芥與單子葉水稻中也均有同源基因但同源性相對較低。該基因在干旱脅迫下的表達量變化及在栽培煙草K326中過表達所呈現出的抗旱表型，表明該基因參與煙草抗旱早期應答的調控過程且具有顯著增強煙草耐受干旱脅迫的功能。