基于FUNGuild的鐮刀菌根腐病發病煙株根際真菌群落研究

李朋發 ，楊龍，李桂龍 ，徐后娟，王玉軍，李忠佩

1 中國科學院南京土壤研究所土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，南京市北京東路71號 210008；

2 中國科學院大學，北京市石景山區玉泉路19號 100049；

3 山東農業大學植物保護學院，泰安市岱宗大街61號 271018

煙草土傳病害嚴重危害我國的煙葉生產[1]。目前，對煙草土傳病害的研究主要集中在三個方面，一是煙草病原菌的致病機理[2-4]；二是植煙土壤微生物群落組成和多樣性[5-6]；三是煙草病害的綜合防治措施[7-9]。而對于煙草土壤微生物群落功能的研究則鮮有報道。弄清煙草土壤微生物群落功能有助于深入了解煙草發病機理。

煙草根際土壤微生物種類繁多，其中真菌是重要的組成部分。受限于技術手段，對煙草根際真菌群落的研究也基本上都集中在群落組成和多樣性上[10-11]。FUNGuild[12]是一個進行真菌功能比對的數據庫，不僅可對真菌的營養類型進行鑒定，還能對真菌進行具體的功能分類。FUNGuild在真菌群落研究中得到了較為廣泛的應用[13-14]。本研究聯合使用Illumina高通量測序技術和FUNGuild軟件，研究了鐮刀菌根腐病煙株與未發病煙株根際土壤真菌群落的組成和功能，旨在深入了解鐮刀菌根腐病發生的土壤微生物學機理，為鐮刀菌根腐病的控制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地位于山東省臨沂市沂水縣（35°97′N，118°37′E），該地區年均氣溫為13.0℃，年均降水量875mm。樣地為坡地，坡頂為林地，坡中和坡底為多年撂荒的新墾煙地，土壤類型為僵心棕堰土。坡中煙地中的煙株大規模發病，經鑒定為鐮刀菌根腐病，平均發病率在95%以上。坡底煙地中的未見鐮刀菌根腐病發病煙株。坡中土壤基本理化性質為：pH 6.41，有機碳8.42 g·kg-1，總氮 0.89 g·kg-1，總磷0.96 g·kg-1，總鉀17.21 g·kg-1，堿解氮 86.65 mg·kg-1，速效磷83.38 mg.kg-1，速效鉀 103.17 mg·kg-1；坡底土壤基本理化性質為：pH 6.38，有機碳8.46 g.kg-1，總氮 0.92 g·kg-1，總磷0.97 g·kg-1，總鉀17.34 g·kg-1，堿解氮 84.75 mg·kg-1，速效磷85.64 mg·kg-1，速效鉀 105.83 mg.kg-1。坡中與坡底土壤在理化性質上無顯著差異。

在坡中、坡底各分別隨機選擇3塊煙地，每個地塊分別隨機選取5株煙株，取煙株根際土并將同一地塊采集的根際土混合。將采集好的土壤樣本加冰袋低溫運輸至實驗室。將土樣分為兩部分，其中一部分立即放入-20℃冰箱保存，用于DNA提??；另一部分過2 mm篩并風干，研磨后過0.149 mm篩，用于土壤理化性質分析。

1.2 土壤DNA提取及PCR擴增

土壤DNA使用MP Fast?DNA試劑盒提?。∕P Biomedicals，CA，USA），提取方法參考試劑盒使用說明書。提取的DNA使用PowerClean?DNA Clean-up Kit（MoBio，CA，USA）進 行 純化。DNA濃度和純度使用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測，結果顯示，經過純化的DNA濃度 均 在30 ng·μL-1以 上，OD260/OD280均 在1.8-2.0之間，濃度和純度均符合ITS擴增要求。使用內轉錄間隔區1（ITS1）的特異性引物（ITS1-F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA[15]/ ITS2-R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[16]）對6個DNA樣本分別擴增，PCR體系和條件參考Li的方法[17]。

1.3 Illumina測序及序列處理

使用Illumina MiSeq PE250測序平臺對擴增產物進行雙端測序。測序數據經過Flash[18]和Trimmomatic[19]進行拼接和質控后，使用微生物生態學定量研究平臺（Quantitative Insights into Microbial Ecology ，QIIME）進行處理。使用UCLUST[20]軟件對各序列在97%的相似性水平下聚類操作分類單位（operational taxonomic units，OTUs），各個OTU的代表序列使用UNITE數據庫（https://unite.ut.ee/）進行物種信息比對[21]。

1.4 數據處理與分析

真菌的營養型、功能分組使用FUNGuild（1.0）軟件進行比對，大體步驟為：（1）將QIIME輸出的OTU表和物種信息表合并，將物種信息附加在OTU表的最后一列并命名為“taxonomy”；（2）將第（1）步得到的表格上傳到FUNGuild網站，開始比對；（3）比對完成后下載輸出結果到本地。輸出結果包含原始的OTU表并依據序列數量進行排序。輸出結果還包含物種的分類單位“Taxon”，物種分類級別“Taxon Level”，營養型“Trophic Mode”，功能分組“Guild”，可信度“Confidence”，生長形態“Growth Morphology”，特征“Trait”，備注“Notes”和比對信息來源“Citation/Source”。

OTU數、OTU相對豐度等使用R語言（3.4.3）進行聚類計算，主坐標分析（Principal coordinate analysis ，PCoA）、ANOSIM檢驗也通過R語言（3.4.3）進行。樣本的描述性分析、組間差異的顯著性分析使用SPSS 19.0中的獨立t檢驗完成。所有圖片均通過Origin（9.1）制作。顯著性檢驗水準均為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 根際真菌群落結構及多樣性比較

經過質控，6個樣本共得到184,782條高質量序列。在97%的相似性水平下聚類OTU，每個樣本按照樣本最少序列數抽平到14,644條序列，6個樣本共聚類得到600個OTU，其中有444條代表序列通過UNITE數據庫比對可鑒定為真菌。

在綱水平下對各樣本的物種進行分類求和，得到各樣本在綱水平下的物種組成，如圖1所示。通過圖1可以看出，未發病（H）與鐮刀菌根腐病（S）煙株的根際真菌群落在物種組成上明顯不同。未發病煙株根際真菌群落中，散囊菌綱（Eurotiomycetes）為優勢菌綱，平均占比為42.81%，糞殼菌綱（Sordariomycetes）次之，平均占比為13.97%。發病煙株根際真菌群落中則正好相反，糞殼菌綱（Sordariomycetes）平均占比為55.06%，糞殼菌綱（Sordariomycetes）平均占比為14.61%。發病煙株根際真菌群落中的傘菌綱（Agaricomycetes）和鳥綱菌綱（Orbiliomycetes）比例均顯著高于未發病煙株（P＜0.05），但是座囊菌綱（Dothideomycetes）的相對豐度在兩組真菌群落中無顯著差異（P＞0.05）。主坐標分析（PCoA）結果顯示，未發病和發病煙株根際真菌群落顯著分異。進一步通過ANOSIM檢驗發現，兩組煙株根際真菌群落的組間差異顯著大于組內差異（P＜0.05）。

圖1 未發病（H）和鐮刀菌根腐?。⊿）煙株根際真菌群落在綱水平上的組成Fig.1 Composition of rhizospheric fungal community in group H (unaffected tobacco) and group S (Fusarium root rot diseased tobacco)

圖2 兩組煙株根際真菌群落組成的主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of rhizosphere fungal communities of group H and group S

分別選取Shannon-Wiener指數、Chao1指數和Observed OTUs指數描述兩組煙株根際真菌群落的多樣性，結果如表1所示，未發病組的三種α多樣性指數（Alpha diversities）均顯著高于鐮刀菌根腐病組（P＜0.05），說明未發病煙株根際真菌群落的多樣性顯著高于鐮刀菌根腐病發病煙株。

表1 兩組煙株根際真菌群落多樣性對比Table 1 Comparison of Alpha diversities of rhizosphere fungal communities between group H and group S

2.2 根際真菌群落營養型比較

根際FUNGuild數據庫的比對結果，對兩組煙株根際真菌的營養型（trophic mode）進行分類統計，結果如圖3所示，未發病煙株根際真菌的營養型以腐生營養型（saprotroph）為主，平均占比46.10%，病理營養型（pathotroph）次之，平均占比22.85%；鐮刀菌根腐病煙株根際真菌的營養型則以病理營養型為主，平均占比54.64%，腐生營養型次之，平均占比12.88%。兩組煙株根際的病理營養型真菌和腐生營養型真菌的相對豐度均具有顯著性差異（P＜0.05）。兩組煙株根際的共生營養型真菌相對豐度均不足1%，但是未發病煙株根際的共生營養型真菌相對豐度顯著低于鐮刀菌根腐病煙株（P＜0.05）。另外，未發病煙株根際有相對更多的真菌營養型尚未鑒別。

圖3 兩組煙株根際真菌群落的營養型組成Fig.3 Trophic composition of rhizosphere fungi communities of group H and group S

2.3 根際真菌病原菌群落比較

在600個OTU中，共有21個OTU經FUNGuild鑒定為植物病原菌（Plant pathogen），其中有6個OTU的鑒定結果可信度（Confidence Ranking）為“Possible”，因此僅對剩余15個鑒定結果可信度為“Probable”和“Highly probable”的高可信病原菌OTU進行分析。

15個高可信度的病原菌OTU分別來自12個菌屬，其中，鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉屬（Gibberella）和青霉菌屬（Penicillium）均有2個OTU被鑒定為高可信病原菌且鐮刀菌屬的兩個OTU均為腐皮鐮孢菌（F.solina），其它9個菌屬均僅有1個OTU被鑒定為高可信病原菌。在所有高可信病原真菌中，鐮刀菌占據絕對優勢地位。在未發病組中，2個鐮刀菌OTU的序列數占病原菌序列總數的75.02%±10.67%，而在鐮刀菌根腐病組中，2個鐮刀菌OTU的序列數占病原菌序列總數的99.10%±0.80%。鐮刀菌根腐病煙株根際的鐮刀菌在序列數和相對豐度上均顯著高于未發病組（P＜0.05）。對兩組煙株根際高可信病原菌OTU進行統計，結果如圖4所示。未發病煙株根際病原真菌相對豐度平均為1.12%，而鐮刀菌根腐病煙株根際病原真菌相對豐度則高達30.73%，差異顯著（P＜0.05）。

圖4 兩組煙株根際病原菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of rhizospheric pathogens of two groups

3 討論

根際微生物區系被稱為植物的第二基因組，對植物的生長發育有決定性的影響[22]。本研究分析了鐮刀菌根腐病發病煙株與未發病煙株根際土壤的ITS測序結果，發現兩種根際土壤的真菌群落組成有顯著差異，未發病煙株根際真菌多樣性顯著高于發病煙株，這與李小龍等對青枯病煙株根際真菌群落的研究結果相吻合[23]。鐮刀菌根腐病發病煙株根際真菌群落多樣性的降低，很可能是鐮刀菌在群落的種間競爭中占據優勢，少數病原菌不斷積累并逐漸成為優勢種，在這個過程中，相應的部分有益菌因為競爭能力弱而被淘汰[24]，物種數減少，多樣性降低。

除群落組成和多樣性外，鐮刀菌根腐病發病煙株與未發病煙株根際真菌的營養型組成也存在顯著差異。在未發病煙株根際，真菌以腐生營養型為主，病理營養型次之，而發病煙株根際真菌的營養型則以病理營養型為主，腐生營養型次之。病理營養型表示真菌通過傷害寄主細胞來獲取自身所需的營養物質，而腐生營養型則表示真菌通過分解死亡的寄主細胞來獲取營養物質[25]。鐮刀菌根腐病發病煙株根際的病理營養型真菌顯著高于未發病植株，說明發病植株根際可能有更多的致病真菌，尤其是鐮刀菌，通過破壞根系細胞來維持自身生長，導致煙株根系組織遭到破壞，進而使病原菌能更加順利地從根系對煙株進行侵染，最終導致煙株發病。

分析結果顯示，發病煙株根際的病原菌相對豐度也顯著高于未發病煙株，2個鐮刀菌在發病煙株根際的病原菌中占據絕對的優勢地位。鐮刀菌是煙草致病菌，可引發煙草的鐮刀菌根腐病[26]。其中，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄病鐮刀菌（F.solani）等是侵染煙草根系并引發根腐病的主要病原菌種[26-27]，主要通過傷害煙草的維管束組織和根系組織等來侵染煙草[27]。因此，聯合使用高通量測序與FUNGuild軟件，可以對土傳病害感病煙株的根際優勢病原真菌群落進行準確的鑒定，同時也可提供豐富的、非優勢的潛在病原真菌信息，這對揭示煙草土傳病害發生的土壤微生物學機理具有重要意義，也可為煙草土傳病害的防控提供科學參考。

4 結論

通過高通量測序與FUNGuild的聯合使用，對鐮刀菌根腐病發病煙株與未發病煙株根際土壤中的真菌群落進行了研究，結果表明：（1）未發病煙株與發病煙株根際的真菌群落在組成上具有顯著差異，未發病煙株根際真菌多樣性顯著高于發病煙株；（2）發病煙株根際真菌的營養型以病理營養型為主，腐生營養型次之，而未發病煙株則正好相反；（3）發病煙株根際的病原菌相對豐度顯著高于未發病煙株，鐮刀菌在病原菌群落中占絕對優勢地位。高通量測序與FUNGuild的聯用，可以對土傳病害感病煙株的根際優勢病原真菌群落進行準確的鑒定，也可為煙草土傳病害的防控提供科學參考。