原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2變化情況及其意義研究

文鐘，青玉鳳，周京國，謝文光，易婷，朱丹，陳剛，李夢蘭，童曉霞

痛風(fēng)是由于血尿酸水平異常升高，尿酸鹽（MSU）晶體析出并沉積于組織或器官引起的一組臨床綜合征［1］。空腹血尿酸水平男性 ＞420 μmol/L（7.0 mg/dl）、女性 ＞357 μmol/L（6.0 mg/dl））即為高尿酸血癥。高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)病的生化基礎(chǔ)，嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少均可導(dǎo)致血尿酸升高。而在血尿酸生成增多的原因中嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血尿酸生成增多僅占10%，剩下的90%均與尿酸轉(zhuǎn)運蛋白導(dǎo)致尿酸排泄減少有關(guān)［2］。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2（ABCG2）作為一種重要的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白，在促進(jìn)尿酸排泄中起關(guān)鍵性作用。研究顯示，歐洲人群中10%的痛風(fēng)患者跟ABCG2異常表達(dá)相關(guān)［3］。既往國內(nèi)外對ABCG2尿酸轉(zhuǎn)運的相關(guān)研究主要集中于腎臟、肝臟、腸道、膽管的ABCG2表達(dá)，方法也主要集中于動物模型的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)［3-6］。針對痛風(fēng)患者外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）的ABCG2研究尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。為此，本研究通過RT-qPCR、Western blotting法比較男性原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者與健康體檢者PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白的表達(dá)差異，進(jìn)一步探討ABCG2在原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中可能起到的作用，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1977年美國風(fēng)濕病協(xié)會（ACR）制定的原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；初診患者；未進(jìn)行任何治療（包括抗炎鎮(zhèn)痛及降尿酸藥物治療）。排除標(biāo)準(zhǔn)：血液系統(tǒng)疾病；腎臟疾病；藥物等引起的繼發(fā)性痛風(fēng)；自身免疫性疾病和其他炎性疾病。選取2016年6月—2017年2月于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診就診及住院的男性原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者（GA組）82例，其中急性期痛風(fēng)（AGA亞組）和間歇期痛風(fēng)（IGA亞組）患者各41例。年齡17～80歲，平均年齡（46±16）歲。依據(jù)患者血尿酸水平進(jìn)一步分為血尿酸＜420 μmol/L痛風(fēng)亞組（NUA亞組）31例、血尿酸≥420 μmol/L痛風(fēng)亞組（HUA亞組）51例。

另選取同期川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心的男性健康體檢者（HC組）46例，年齡18～78歲，平均年齡（47±13）歲。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑

1.2.1.1 主要儀器 紫外分光光度計（Agilent 公司），低溫高速離心機(jī)5417R（Eppendorf 公司），Q12K Flex型RT-qPCR儀（Applied Biosystem公司，美國），PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD公司，美國），電泳儀（BIO-RAD公司，美國），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國），電泳儀（BIO-RAD公司，美國），小型垂直式蛋白質(zhì)電泳槽（BIO-RAD公司，美國），轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD公司，美國），酶標(biāo)儀（Benchmark公司，德國），-80 ℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2.1.2 主要試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），熒光染料試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI公司，美國），瓊脂糖（北京艾德萊生物科技有限公司），GreenView核酸染料（成都博瑞克生物技術(shù)有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，BIO-RAD公司，美國），GAPDH抗體（Ruiying Biological公司），ABCG2抗體（Abcam公司，美國），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免抗鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 設(shè)計引物 依據(jù)Gene Bank中人ABCG2及內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin）進(jìn)行序列設(shè)計，并用于RT-qPCR檢測。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.2.3 檢測指標(biāo) 采集受試者清晨空腹靜脈血，采用全自動生化分析儀（ Beck Man Coulter Unicel DxC 800）檢測血尿酸、肌酐、胱抑素C（Cys-C）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平；采用血細(xì)胞分析儀（LH750）檢測紅細(xì)胞沉降率（ESR）。

1.2.4 血標(biāo)本采集及PBMCs提取 采集受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml（肝素鈉抗凝），3 000 r/min離心5 min（離心半徑20 cm）分離血漿，加入等量磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混勻，將已混勻的靜脈血緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心5min（離心半徑20 cm）分離PBMCs，加入3 ml PBS，2 000 r/min離心10 min（離心半徑20 cm），再轉(zhuǎn)移至1.5 ml焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的EP管中備用。

1.2.5 PBMCs總RNA提取及cDNA制備 將提取的PBMCs加入Trizol試劑，嚴(yán)格按照操作提取總RNA，以紫外分光光度儀測定RNA。D260/D280在1.8～2.0為合格。將合格的RNA濃度調(diào)整為100 ng/ml。cDNA的合成嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42 ℃ 2 min；第二步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42 ℃ 15 min；終止反應(yīng)。將cDNA產(chǎn)物于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 RT-qPCR法檢測PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平 將cDNA以20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增：SYBR? Premix Ex Taq ? Ⅱ （2X）10.00 μl，ROX Dye Ⅱ（50×） 0.40 μl，上游引物（10 μmol/L）0.15 μl，下游引物（10 μmol/L）0.15 μl，cDNA 2.00 μl，雙蒸水7.30 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，兩步法擴(kuò)增：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。操作均在Q12K Flex型RT-qPCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.2.7 Western blotting法檢測PBMCs ABCG2表達(dá)水平PBMCs提取步驟同上，取40 μl進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、電轉(zhuǎn)，脫脂奶粉封閉液封閉1 h。加入特異性一抗（兔抗人ABCG2抗體或GAPDH抗體），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（TBST）洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，洗滌后曝光顯影。采用Image J圖像分析軟件掃描分析條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH的條帶灰度值比值代表目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以M（QR）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較 GA組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平高于HC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 ABCG2及β-actin引物序列Table 1 ABCG2 and beta-actin gene primer sequences

表2 GA組與HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較〔M（QR）〕Table 2 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in GA group and HC group

AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中IGA亞組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平高于AGA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平低于IGA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AGA亞組與HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

表3 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較〔M（QR）〕Table3 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

NUA亞 組、HUA亞 組、HC組 PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中HUA亞組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平高于NUA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平低于HUA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NUA亞組與HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表4）。

表4 NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平比較〔M（QR）〕Table 4 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

2.2 PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中IGA亞組PBMCs ABCG2表達(dá)水平高于AGA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平低于IGA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AGA亞組與HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表5、圖1）。

表5 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較（±s）Table 5 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

表5 AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較（±s）Table 5 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

注：與AGA亞組比較，aP＜0.05；與IGA亞組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) ABCG2 AGA亞組 41 0.45±0.16 IGA亞組 41 0.73±0.27a HC組 46 0.48±0.14b F值 5.858 P值 0.008

圖1 Western blotting 法檢測AGA亞組、IGA亞組、HC組PBMCs ABCG2 表達(dá)水平的凝膠電泳圖Figure 1 Gel electrophoresis of expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group by Western blotting

NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中HUA亞組PBMCs ABCG2表達(dá)水平高于NUA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平低于HUA亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NUA亞組與HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表6、圖2）。

表6 NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較（±s）Table 6 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

表6 NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2表達(dá)水平比較（±s）Table 6 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

注：與NUA亞組比較，aP＜0.05；與HUA亞組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) ABCG2 NUA亞組 31 0.43±0.15 HUA亞組 51 0.72±0.26a HC組 46 0.48±0.14b F值 6.319 P值 0.006

圖2 Western blotting 法檢測NUA亞組、HUA亞組、HC組PBMCs ABCG2 表達(dá)水平的凝膠電泳圖Figure 2 Gel electrophoresis of expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group by Western blotting

2.3 ABCG2 mRNA表達(dá)水平與血尿酸水平、肌酐水平、Cys-C水平、ESR、hs-CRP水平的相關(guān)性分析男性原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血尿酸水平、肌酐水平、Cys-C水平、ESR、hs-CRP水平分別為（484.4±130.8）μmol/L、（84.8±20.3）μmol/L、0.8（0.3）mg/L、（21.3±16.6）mm/1 h和 5.6（15.8）mg/L。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，男性原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平與血尿酸水平呈正相關(guān)（r=0.235，P=0.033），與肌酐水平、Cys-C水平呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.227、-0.229，P值分別為0.044、0.043），與ESR、hs-CRP水平無直線相關(guān)關(guān)系（r值分別為-0.181、0.027，P值分別為0.112、0.824）。

3 討論

20世紀(jì)90年代 DOYLE等［8］首次發(fā)現(xiàn) ABCG2，該蛋白由ABCG2基因編碼，定位于4q22.1，基因ID：9429，由655個氨基酸構(gòu)成，蛋白分子量為72 kDA。ABCG2是一種定位于細(xì)胞膜的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在腎臟近端腎小管上皮的頂膜（刷狀緣），小腸、大腸的黏膜上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)［9-10］。ABCG2已知的功能主要有2種：（1）限制化療藥物［11］、免疫抑制劑［12］、抗病毒藥物［13］向靶向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致多藥耐藥；（2）參與生理屏障（血-腦脊液［14］、血-胎盤［15］、血生精小管屏障［16］）保護(hù)作用。

近年來研究又證實ABCG2還參與了尿酸的外排轉(zhuǎn)運，其中WOODWARD等［3］對表達(dá)人ABCG2的非洲爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行尿酸清除率的計算，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)尿酸鹽含量下降達(dá)75%，可見ABCG2的尿酸轉(zhuǎn)運能力極強(qiáng)，是一種高容量尿酸轉(zhuǎn)運蛋白。另外HOSOMI等［5］及ICHIDA等［6］的研究也證實ABCG2有轉(zhuǎn)運尿酸的能力。其中HOSOMI等［5］通過計算高尿酸血癥小鼠模型體內(nèi)腎臟、腸道和肝臟等部位的尿酸清除效率，發(fā)現(xiàn)腎臟及腸道均是尿酸的排泄器官。而ICHIDA等［6］也發(fā)現(xiàn)在加入三磷酸腺苷（ATP）的高尿酸血癥模型組小鼠中ABCG2表達(dá)水平明顯升高，尿酸排泄能力明顯高于未加入ATP的高尿酸血癥模型組小鼠。

ABCG2表達(dá)于全身多個組織器官，但PBMCs中是否同樣有ABCG2表達(dá)并參與尿酸轉(zhuǎn)運尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。基于以上思路，本課題組選取男性原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者及健康體檢者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GA組PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平高于HC組，進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，IGA亞組PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于AGA亞組和HC組，而AGA亞組與HC組間的PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平無差異。以上結(jié)果首先得出了ABCG2在PBMCs中表達(dá)，其次進(jìn)一步按照炎癥狀態(tài)分組（AGA、IGA亞組）并未發(fā)現(xiàn)在炎癥狀態(tài)最重的急性期（AGA亞組）出現(xiàn)ABCG2高表達(dá)，反而是炎性消退的間歇期（IGA）出現(xiàn)了ABCG2高表達(dá)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，患者PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平與炎癥指標(biāo)ESR、hs-CRP水平并無直線相關(guān)關(guān)系。而痛風(fēng)經(jīng)典的炎癥過程是單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞在吞噬尿酸鹽晶體后激活Toll樣受體及NOD樣受體介導(dǎo)的免疫炎性信號通路，釋放白介素（IL）-1β等炎性因子而引起的炎癥瀑布反應(yīng)［17］。ABCG2并不參與這兩條炎性通路中的任何一條，且國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)也未見ABCG2參與痛風(fēng)炎癥的相關(guān)報道。綜上，ABCG2可能并不參與痛風(fēng)的炎癥過程。

尿酸是小分子物質(zhì)，進(jìn)入PBMCs內(nèi)的尿酸如何向外周血中轉(zhuǎn)運值得探究。為此，本研究將GA組患者按照尿酸水平分為NUA亞組、HUA亞組進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)HUA亞組PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于NUA亞組和HC組，而NUA亞組和HC組間PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平無差異；PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平與血尿酸水平呈正相關(guān)。可見在PBMCs中表達(dá)的ABCG2參與了尿酸向外周血轉(zhuǎn)運的過程，轉(zhuǎn)運到PBMCs外的尿酸通過血液循環(huán)進(jìn)入腎臟等組織而排出體外。PBMCs ABCG2 mRNA表達(dá)水平與肌酐、Cys-C水平呈負(fù)相關(guān)；提示血尿酸水平可能下調(diào)了存在腎功能損害的痛風(fēng)患者PBMCs ABCG2的表達(dá)。推測出現(xiàn)上述情況可能是為了避免腎臟進(jìn)一步損害，限制PBMCs中表達(dá)的ABCG2將尿酸向外周血轉(zhuǎn)運，達(dá)到減輕腎臟負(fù)擔(dān)的作用。但這個結(jié)論目前只是初步推測，還需后期實驗進(jìn)一步證實。

本研究尚存在一定不足之處，主要是未能同時加入痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)液進(jìn)行對比分析，后期實驗可以增加相關(guān)內(nèi)容，并通過基因敲除體外細(xì)胞實驗進(jìn)一步研究ABCG2在PBMCs中的作用機(jī)制。而由于PBMCs易在外周血中獲取，如果能通過獲取痛風(fēng)或高尿酸血癥患者血液而快速檢測包括ABCG2在內(nèi)的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)是否異常，不僅有利于尋找痛風(fēng)發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，還能為原發(fā)性痛風(fēng)患者的靶向治療提供實驗室。

綜上所述，ABCG2在PBMCs中表達(dá)并參與尿酸的轉(zhuǎn)運，未發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥過程相關(guān)；PBMCs ABCG2 mRNA與肌酐、Cys-C呈負(fù)相關(guān)，提示存在腎功能異常的痛風(fēng)患者可能會下調(diào)ABCG2在PBMCs中的表達(dá)，這可能有利于腎臟的保護(hù)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。