柿葉總黃酮提取純化工藝研究

周雅陽，杜 江

(貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002)

柿葉為柿科柿屬植物柿(DiospyroskakiThunb.)的新鮮或干燥葉，在我國分布廣泛，作為藥用植物具有悠久的歷史，始載于《滇南本草》[1]，《本草再新》中記載其具有治療咳嗽吐血、止渴生津之功效。柿葉中含有豐富的維生素、蘆丁以及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的多功能營養成分，現代藥理學研究表明柿葉具有清熱解毒、潤肺強心、鎮咳止血、改善血管通透性等多種醫療保健功能[2]。黃酮作為柿葉的有效成分之一，具有降血糖、抗菌、抗腫瘤、止血、調血脂、改善微循環等藥理作用[3-5]，藥用價值高，開發前景樂觀。目前，國內對柿葉中總黃酮的研究報道頗多，但提取工藝不盡相同，也沒有進行深入探討和比較。因此，本實驗對柿葉有效部位總黃酮的提取純化工藝進行系統研究，為柿葉的開發利用提供實驗依據。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，LC-20A色譜工作站)；電子天平(ME204E/02梅特勒-托利多儀器有限公司)；冷凍干燥機(LGS-18，北京松源華興科技發展有限公司)；旋轉蒸發儀(RE-52A，上海亞榮生化儀器廠)。

山柰酚對照品(批號：110861-201310)、槲皮素對照品(批號：100081-200907)，購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇；色譜乙腈；磷酸(分析純)；純凈水等。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 色譜條件 在文獻[6]基礎上調整，色譜柱：Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和保護柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，檢測波長360 nm，柱溫35 ℃，流速1 mL/min。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜(1.槲皮素；2.山柰酚)

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取適量槲皮素、山柰酚對照品，加甲醇制成每1 mL含槲皮素51.1 μg、山柰酚48.8 μg的溶液，即得。

2.1.3 標準曲線繪制 分別將對照品溶液稀釋1、1.25、2、10、25、50倍，進樣10 μL，記錄峰面積。以對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y進行線性回歸。槲皮素和山柰酚的回歸方程分別為：Y=42628X-11233，r=0.9999；Y=42486X-13625，r=0.9999。結果表明：槲皮素濃度在1.02～51.1 μg/mL范圍內，山柰酚濃度在0.976～48.8 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。見圖2、圖3。

圖2 槲皮素的標準曲線

圖3 山柰酚的標準曲線

2.1.4 供試品溶液制備 (1)藥材總黃酮含量測定。取0.5 g柿葉粉末，精密稱定，加50 mL甲醇，稱重，超聲處理60 min，放冷并補足損失的重量，離心，精密吸取上清液10 mL，加甲醇-25%鹽酸(2∶1)15 mL，加熱回流30 min，放冷，轉移至50 mL量瓶，加甲醇至刻度，濾過，取續濾液20 μL進樣測定，柿葉總黃酮含量為0.43%。總黃酮含量=(A1+11233)/(42628×2000)+(A2+13625)/(42628×2000)，A1：樣品槲皮素峰面積，A2：樣品山柰酚峰面積。

(2)提取物總黃酮含量測定。精密稱定樣品0.1 g，加甲醇：25%鹽酸溶液(2∶1)15 mL，加熱回流30 min，冷卻，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。總黃酮含量計算公式同上。

2.2 柿葉總黃酮提取工藝單因素考察

2.2.1 提取溶劑考察 稱取20 g柿葉粉末5份，分別加入15倍量的0、30、50、75、95%的乙醇水溶液，加熱回流2次，每次1.5 h，合并濾液，干燥得總黃酮粗提物，75%乙醇提取的黃酮純度、得率較高，故選擇75%乙醇為提取溶劑。結果見表1。

總黃酮得率=(提取物中總黃酮的質量/原料的質量)×100，粗提物中總黃酮純度(提取物中總黃酮的質量/粗提物的質量)×100，后續實驗中柿葉總黃酮得率及粗提物總黃酮純度也按此法計算。

表1 提取溶劑考察結果 (%)

2.2.2 物料比考察 稱取20 g柿葉粉末4份，分別加入8、10、15、20倍量的75%乙醇溶液，其他操作同“2.2.1”，綜合黃酮純度、得率及提取成本考慮，選擇15倍量。結果見表2。

表2 提取溶劑考察結果

2.2.3 提取時間考察 稱取20 g柿葉粉末3份，加入15倍量的75%乙醇溶液，分別加熱回流0.5、1、1.5 h，其他操作同“2.2.1”項，提取1 h時黃酮純度、得率最高，故選擇1 h為提取時間。結果見表3。

表3 提取時間、次數的考察結果

2.2.4 提取次數考察 稱取20 g柿葉粉末，加入15倍量的75%乙醇，加熱回流3次，每次1 h，分別干燥濾液，稱定3份浸膏的質量，綜合考慮浸膏質量、黃酮純度及成本，選擇提取2次。結果見表3。

2.3 柿葉總黃酮純化工藝研究

2.3.1 總黃酮粗提物制備 稱取柿葉粉末40 g，加入15倍量75%乙醇，加熱回流2次，每次1 h，抽濾，合并濾液，濃縮，冷凍干燥成浸膏，備用。

2.3.2 純化工藝比較 (1)酸水解法。取浸膏1 g，精密稱定，加入50 mL的水解液，水浴水解1 h(80 ℃，磁力攪拌)，離心，沉淀用水洗滌，收集上清液，干燥。5%硫酸水解液純化的黃酮純度及得率最高。結果見表4。

表4 水解液對黃酮純化工藝的影響結果

(2)萃取法。取浸膏1 g，精密稱定，加入15 mL水成混懸液，依次用1倍量石油醚、2倍量乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯層，干燥，得浸膏0.24 g，黃酮純度為12.6%。

(3)大孔樹脂法。大孔吸附樹脂預處理后，濕法裝柱，取1 g浸膏，精密稱定，用蒸餾水配制成濃度為3 mg/mL的溶液上柱，去離子水洗至流出液無色，依次按10、50、75%乙醇以1 BV/h流速洗脫，收集，干燥，計算浸膏質量及黃酮純度。結果見表5。

表5 洗脫液對黃酮純化工藝的影響結果 (%)

3 討論

黃酮類化合物主要以苷類的形式存在，根據相似相溶原理，黃酮苷一般可溶于熱水、甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑中，用乙醇提取黃酮類化合物是目前使用較多的一種方法[7-8]。柿葉總黃酮的提取方法較多，如林國榮等[9]采用水提法，固液比1∶10，溫度75 ℃，提取時間2 h；吉俊生等[10]采用濃度為70%乙醇提取，料液比1∶10，提取時間為1 h，提取2次；楊露等[11]采用超聲法提取，以40倍量的40%乙醇為溶劑，在60 ℃下超聲50 min。盡管提取方法多樣，但黃酮純度及得率并不高。

本實驗在此基礎上研究了柿葉中總黃酮的提取工藝，采用單因素試驗考察了提取所用溶劑、物料比、提取時間、提取次數，確定了最優條件為15倍量的75%乙醇加熱回流2次，每次1 h。在柿葉總黃酮純化工藝研究中，分別采用了萃取法、酸水解法、大孔樹脂純化法，發現依次用1倍量石油醚、2倍量乙酸乙酯分別萃取6次精制后的黃酮純度為12.6%，回收率在95%以上。萃取法與其他方法相比工藝簡單，成本低，效率較高，實用性較強。

柿葉為民間常用藥材，資源十分豐富，其藥用價值和保健作用越來越受到人們的重視，但柿葉的研究多側重于有效成分的提取，對藥理藥效、制劑制備及其臨床應用的深入挖掘甚少。今后應注重加強柿葉制劑的研發和臨床應用的開發，尤其在研究較為成熟的心腦血管疾病領域開發出療效顯著的柿葉產品。