鐵皮石斛與其他不同品種石斛HPLC特征圖譜比較研究

宋紅坤，蔣明明，林 濤，劉興勇，王繼良，劉宏程*

(1.昆明醫科大學 藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明650500；2.云南省農業科學院 質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明650205)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)植物，是我國名貴中藥材，始載于《神農本草經》，列為上品。鐵皮石斛性味甘，微寒，歸胃、腎經，具有滋陰清熱、益胃生津之功效[1-2]。現代藥理學研究證明，鐵皮石斛可用于慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病等癥的治療，具有抗腫瘤、抗衰老等作用[3]。2010版《中華人民共和國藥典》(下簡稱《中國藥典》)將鐵皮石斛從石斛中分開，單列一味，足見其作用特殊。

鐵皮石斛主要分布于浙江、廣西、福建和云南等地。由于鐵皮石斛特殊的生長環境和人們的不合理采掘，鐵皮石斛的野生資源已日趨枯竭，鐵皮石斛是目前人工栽培最主要的石斛品種。石斛種類繁多，致使鐵皮石斛市場假冒、偽劣等現象嚴重。雖然 2010 版《中國藥典》將鐵皮石斛獨立建立品系，但在市場上還未規范化。目前鐵皮石斛仍主要以外觀性狀鑒別和以多糖含量為指標，這樣的鑒別方法既難以測定鐵皮石斛有效成分的含量，加工成商品后又難以辨別是否含有鐵皮石斛成分，嚴重影響了鐵皮石斛的產品質量和市場形象。

石斛真偽鑒別及質量受到重視，各種鑒別技術也在不斷發展。石斛鑒別常用方法有傳統顯微鑒定、化學指紋圖譜、DNA指紋圖譜等[4]，HPLC指紋圖譜適用普遍，作為化學指紋圖譜是中草藥領域質量評價公認方法，其作為樣本自身的化學條碼側重于對品質的鑒定，反映的化學成分信息既有種內的共性，又因種類不同而具有差異性。因此，化學指紋圖譜兼具了表征屬性識別和質量控制技術，能為石斛真偽鑒別及質量評價提供強有力的手段。

目前，基于色譜指紋圖譜的石斛鑒別研究主要是建立一種待鑒別石斛的指紋圖譜，再以該指紋圖譜和其他種類石斛圖譜比較，該方法針對性強[5-6]。本實驗應用HPLC技術，采用全輪廓指紋圖譜方法進行了鐵皮石斛HPLC特征圖譜的研究，并對其他七個品種石斛(流蘇、球花、紫皮、金釵、鼓槌、苞鞘、兜唇)進行特征圖譜的比較研究，以期對鐵皮石斛質量標準的建立及市場的規范化提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(四元梯度洗脫系統，配備2998紫外檢測器、Empower 3操作軟件，美國Waters公司)；AB204-N型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500-E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

采集鐵皮石斛，編號為S1～S13，其中5批鮮品鐵皮石斛(S1、S2、S3、S4、S5)、1批鮮品硬角鐵皮石斛(S10)、2批鮮品鐵皮石斛雜交種(S11、S12)、1批干品鐵皮楓斗(S13)采自云南省德宏州石斛種質資源庫，1批鮮品鐵皮石斛(S6)采自云南廣南，1批鮮品鐵皮石斛(S7)采自浙江，1批鮮品鐵皮石斛采自霍山(S8)，1批鮮品鐵皮石斛(S9)采自串朋；其他7種石斛鮮品各1批采自云南省德宏州石斛種質資源庫。取上述收集的鮮品石斛藥材莖，將其剪碎后，在60 ℃的電熱鼓風干燥箱下烘干，打粉，過60目篩，備用；干品石斛藥材，打粉，過60目篩，備用。所有石斛藥材經云南省農業科學研究院質量標準與檢測技術研究所劉宏程研究員鑒定確認。11種對照品：對羥基苯甲酸、香草酸(批號分別為20161208、20171215，國藥集團化學試劑有限公司)、丁香酸、阿魏酸(批號分別為201801291、201801161，成都艾科達化學試劑有限公司)、東莨菪內酯、石斛酚(批號分別為110768-200504、111875-201202，中國食品藥品檢定研究院)、濱蒿內脂、柚皮素(批號分別為R21A9F59551、518co21，北京索萊寶科技有限公司)、香豆素(批號LD20R25，北京百靈威科技有限公司)、芹菜素(批號171019，北京世紀奧科生物技術有限公司)、毛蘭素為實驗室自制(純度均>98.0%)；乙腈甲醇為色譜純(德國Merck公司)；冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司)；娃哈哈礦泉水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 鐵皮石斛HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK MG ⅡC18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈為流動相A，以體積分數為0.2%冰醋酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫：0～35 min為5%A→32%A，35～57 min為32%A→65%A，57～60 min為65%A→5%A；檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

2.1.2 對照品溶液制備 分別取11種對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，色譜甲醇定容至10 mL，搖勻，制成混標溶液備用。

2.1.3 供試品溶液制備 取石斛粉末2.0 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學考察 (1)精密度試驗。精密吸取同一批次鐵皮石斛供試品溶液10 μL，連續進樣6次，分別對共有峰的相對保留時間及峰面積比值進行考察，結果表明各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3%，符合指紋圖譜分析要求。

(2)穩定性試驗。精密吸取同一批次鐵皮石斛供試品溶液10 μL，分別于0、4、8、12、16、24 h進樣分析，考察主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，其RSD均<3%，表明24 h內供試品溶液穩定性較好。

(3)重復性試驗。取同一批鐵皮石斛樣品6份，分別制備供試品溶液，精密吸取鐵皮石斛各供試品溶液10 μL進樣分析。考察主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，其RSD均<3%，指紋圖譜的全貌無明顯變化，符合指紋圖譜要求。

2.1.5 樣品檢測 精密吸取鐵皮石斛供試品溶液10 μL，按色譜條件進樣分析。

2.1.6 特征圖譜的建立與分析 (1)相似度分析。采用國家藥典委員會《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》，以平均數法生成特征圖譜共有模式，計算S1～S13與共有模式的相似度分別為0.924、0.807、0.881、0.927、0.886、0.919、0.841、0.926、0.941、0.791、0.903、0.882、0.929。見圖1。

圖1 13批鐵皮石斛HPLC特征圖譜重疊

(2)色譜峰的標定。根據13批鐵皮石斛供試品溶液的測定結果，共標示出55個特征共有峰，經對照品指認出11個峰，分別是16號峰對羥基苯甲酸，19號峰香草酸，21號峰丁香酸，31號峰東莨菪內脂，32號峰阿魏酸，39號峰濱蒿內酯，40號峰香豆素，48號峰柚皮素，49號峰芹菜素，52號峰石斛酚，55號峰毛蘭素。見圖2。

圖2 13批鐵皮石斛HPLC特征圖譜共有模式

2.2 鐵皮石斛與其他8個品種石斛HPLC特征圖譜比較

2.2.1 樣品檢測 按照鐵皮石斛HPLC特征圖譜建立的色譜條件和供試品溶液制備方法，分別精密吸取8個品種石斛供試品溶液10 μL，按色譜條件進樣分析。

2.2.2 相似度分析 采用國家藥典委員會《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》，以鐵皮石斛為對照圖譜，計算鐵皮石斛與流蘇石斛、球花石斛、紫皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、苞鞘石斛的相似度分別為0.252、0.464、0.875、0.354、0.338、0.169、0.794。見圖3。

圖3 8種石斛HPLC特征圖譜比較

色譜峰的標定：將11種對照品混標溶液在上述色譜條件下進樣，對比相對保留時間可知，1號峰為對羥基苯甲酸，2號峰為香草酸，3號峰為丁香酸，4號峰為東莨菪內脂，5號峰為阿魏酸，6號峰為濱蒿內脂，7號峰香豆素，8號峰柚皮素，9號峰芹菜素，10號峰石斛酚，11號峰毛蘭素。11種成分在不同品種石斛中的檢識情況。見表1。

8種石斛HPLC主要峰群比較分析：實驗結果表明，不同石斛品種之間化學成分和含量有較大差異。石斛的HPLC圖譜主要由4組色譜峰組成，如圖3所示。第1組峰，保留時間tR<14 min，該組峰特征性不強；第2組峰，14 min

表1 11種成分在8種石斛中的檢識結果

注：“-”表示在該批藥材中未檢出。

3 討論

目前可加工為石斛楓斗的原植物來源廣泛，市場上甚至把一些歷來不作藥用的石斛屬及非石斛屬植物也加工冒充鐵皮石斛楓斗，造成了石斛市場混亂的現狀。

本研究通過對13批鐵皮石斛的特征圖譜分析，共標定了55個特征峰，13批樣品的相似度為0.791～0.929。其中樣品S10的相似度為0.791，較其他批次的相似度低。本研究也將鐵皮石斛和流蘇石斛、球花石斛、紫皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、苞鞘石斛進行了HPLC特征圖譜的比較，發現只有紫皮石斛、苞鞘石斛和鐵皮石斛的相似度較高，其相似度分別為0.875、0.794，其他5個品種石斛和鐵皮石斛的相似度較低，并且5個品種石斛之間的相似度也比較低。說明該指紋圖譜可以作為鐵皮石斛鑒別的參考依據，在此研究基礎上可以將鐵皮石斛、紫皮石斛、苞鞘石斛作進一步的藥效學研究，為尋找鐵皮石斛的替代品提供參考依據。此外，8個品種石斛主要色譜峰的數目、峰形等都存在較大差異，說明8個品種石斛所含化學成分存在較大差異，可以為尋找新石斛類藥材來源提供一定的實驗數據。由于藥材化學成分受生長年限、生長環境、采收時間等影響較大，本次試驗所收集的樣品有限，故不能完全代表藥材中所含成分含量，還需收集多批次樣品進行深入的研究。

本研究所建立的HPLC全輪廓指紋圖譜信息豐富，但對強揮發性而未有很好紫外吸收的物質，是DAD檢測器的一個盲區，需串聯MS等檢測器進行補充和完善。樣品共有峰和相似度對評價中藥材質量的共性有重要價值，但不同品種指紋圖譜相互間的差異也有重要意義，可采用統計軟件進行聚類分析、多重方差分析及主成分分析等，為石斛的系統研究提供可靠依據[7]。