白花蛇舌草提取物對膿毒癥模型小鼠肝組織病理及IL-6、IL-1β和TNF-α的影響

何枝華，彭夢媛，王穎芳，2*

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州510006；2.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州510006)

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，是發病率和死亡率極高的臨床綜合征，全球每年有數百萬人罹患膿毒癥，其中25%甚至更多的患者死亡[1]。如何改善膿毒癥患者機體的免疫功能，降低病死率是目前亟待解決的問題。中醫認為感染屬于毒熱證范疇，病機為“熱毒熾盛”，而膿毒癥各個時期都可存在嚴重感染，使用清熱解毒法解決“毒邪”這一主要矛盾，可取得良好療效[2-5]。

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld. 的干燥全草。微苦、微甘、微寒，歸心、肝、脾經，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。臨床常用于治療闌尾炎、肝炎、泌尿系統感染、支氣管炎、扁桃體炎、喉炎等多種炎癥疾病，但其作用機理尚不明確，報道極少。本實驗觀察了白花蛇舌草提取物對膿毒癥小鼠炎癥的影響，通過檢測小鼠血清炎癥因子水平和肝臟的病理學變化，探究其抑制膿毒癥小鼠炎癥可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠80只，雌雄各半，體重18～22g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2016-0041。

1.2 藥物與試劑

白花蛇舌草(廣東省中醫院大學城醫院提供，提取物由實驗室自制)；LPS(北京索萊寶科技有限公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(廣東省中醫院大學城醫院)；小鼠ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)。

1.3 儀器

低溫高速離心機(德國HERMLE)；電子天平(日本Satorius)；酶聯分析儀(Tecan genio公司)；BH-2顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

2 試驗方法

2.1 動物分組、建模及給藥

將80只小鼠按體重隨機分為空白對照組、模型組、地塞米松干預組和白花蛇舌草水提組、白花蛇舌草醇提組，地塞米松干預組和白花蛇舌草水提組、醇提組連續灌胃7天，其余各組給予等體積生理鹽水；末次給藥30 min后，除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模，空白組給予等體積生理鹽水，1次/天持續至實驗結束。

2.2 指標觀測

2.2.1 動物臨床癥候觀察 造模后分別于6 h、12 h、24 h、48 h觀察各組小鼠體表癥狀，如精神、食欲、大小便、毛發色澤等。

2.2.2 血清炎癥因子檢測 于造模后6 h、12 h、24 h、48 h小鼠眼眶取血，分離血清備用，按ELISA試劑盒步驟進行操作，檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

2.2.3 肝臟組織病理觀測 分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h采用頸椎脫臼法處死小鼠，統一剪取肝左上葉置于中性福爾馬林溶液中固定，經脫水、包埋、切片、HE染色等操作后于光鏡下觀察病理變化。

2.3 數據處理與分析

3 實驗結果

3.1 小鼠臨床癥候觀察

空白組小鼠反應敏捷，精神、食欲、大小便均正常，毛發均勻光澤。模型組小鼠在造模6 h后開始出現精神萎靡，毛發蓬松不潔，寒顫發抖，大小便失禁，食欲下降等臨床癥候，12 h后癥狀開始明顯加重。白花蛇舌草提取物組造模后同時間段也出現進食減少、活動量減少的癥狀，但呼吸、精神、毛發等情況均明顯優于模型組，24 h后上述癥狀開始明顯好轉。

3.2 小鼠血清炎癥因子水平比較

與空白對照組比較，模型組的小鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，白花蛇舌草水提組、醇提組小鼠血清炎癥因子IL-6水平顯著高于空白組(P<0.01)，IL-1β、TNF-α水平也明顯高于空白組(P<0.05)，但各時間節點上述炎癥因子水平均顯著低于模型組(P<0.05)，6-12 h時間段各炎癥因子達到峰值，24 h時各炎癥因子水平顯著低于6 h時炎癥因子水平(P<0.01)，48 h后開始趨于正常水平。見表1、表2、表3。

表1 各組小鼠血清IL-6水平比較

組別動物數(n)6h12h24h48h空白對照組164.47±0.381.62±0.070.41±0.140.34±0.46模型組1613.62±0.11??11.70±1.01??2.64±1.560.65±0.14?地塞米松組1610.37±0.31??▲2.67±0.45▲1.31±0.460.58±0.98?HD水提物組1611.45±0.42??▲9.51±1.81??1.48±0.32?0.62±0.18?HD醇提物組1611.32±0.04??▲10.08±2.83??1.81±0.820.54±0.07?

注：與空白組比較，**P<0.01；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.01；與模型組比較，●P<0.05。下同。

表2 各組小鼠血清IL-1β水平比較

組別動物數(n)6h12h24h48h空白對照組160.26±0.070.17±0.070.28±0.060.30±0.07模型組161.94±1.36?1.75±0.870.29±0.060.41±0.13地塞米松組160.38±0.13▲0.21±0.10▲0.26±0.030.31±0.10HD水提物組161.34±0.21?0.25±0.04▲0.28±0.010.37±0.13HD醇提物組161.25±0.27?0.24±0.04▲0.27±0.020.28±0.02

表3 各組小鼠血清TNF-α水平比較

組別動物數(n)6h12h24h48h空白對照組160.20±0.020.11±0.000.04±0.040.16±0.07模型組160.88±0.74?0.25±0.160.10±0.03?0.08±0.02?地塞米松組160.22±0.03●0.08±0.04●0.13±0.07?0.11±0.04HD水提物組160.31±0.12●0.09±0.06●0.07±0.050.06±0.04?HD醇提物組160.34±0.12●0.11±0.020.09±0.040.08±0.03?

3.3 小鼠肝臟組織病理變化

正常組小鼠肝臟肝小葉結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，未見腫脹、變性或壞死。模型組小鼠肝細胞可見明顯腫脹、變性，大部分細胞邊界及細胞核模糊不清，有炎性細胞浸潤，肝細胞脂肪樣變性，可見部分細胞凋亡，24 h后，病變情況逐漸減輕。白花蛇舌草提取物組和陽性組小鼠肝損害較模型組明顯減輕，肝小葉結構較清晰，少數肝細胞有輕微水腫，其余未見明顯異常變化。見圖1。

圖1各組小鼠肝組織病理變化(HE染色，×200)

4 討論

膿毒癥是創傷、燒傷、休克、感染等臨床急危重患者的嚴重并發癥之一，也是誘發膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要原因。膿毒癥嚴重時，由于內毒素刺激機體，促使炎性細胞特別是中性粒細胞和巨噬細胞在組織中募集和活化，然后分泌一系列炎癥介質如細胞因子、趨化因子、氧自由基及蛋白酶等，互成反饋，不斷擴大炎性反應，形成瀑布樣級聯反應[6-7]。據研究表明，病原微生物與TLR4受體結合后激活特異的下游信號傳導通路，介導大量炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6，以及次一級炎癥介質等的合成和釋放與膿毒癥的形成緊密相關[8]。

基于此，本研究通過雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測LPS膿毒癥模型小鼠各時間節點血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量變化，并結合肝臟病理學變化，觀察白花蛇舌草提取物對LPS膿毒癥小鼠炎癥的干預效果，探討白花蛇舌草提取物對外周血中相應炎癥因子蛋白表達的調節作用，進一步明確白花蛇舌草的抗炎作用機制。

本實驗結果提示，白花蛇舌草水提取物和醇提取物均能夠有效改善LPS膿毒癥小鼠的肝損傷，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α水平，其作用機制可能是通過抑制這些炎癥因子的表達，來調節固有免疫系統的平衡，從而達到治療效果。

有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信號轉導途徑在膿毒癥發生發展中起著重要作用，胞外的LPS通過細胞膜上的TLR4受體激活胞內的NF-κB轉錄因子最終導致多種炎癥介質的大量轉錄表達[9]。下一步本課題組擬應用Real-time Quantitative RT-PCR方法研究TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的關鍵因子在白花蛇舌草提取物干預LPS膿毒癥模型小鼠后多個時間點肝組織中的轉錄水平，進一步驗證白花蛇舌草提取物在固有免疫方面的抗炎作用機制，明確其作用靶點，為白花蛇舌草在臨床上的進一步應用提供參考依據。