EGCG對人肝星狀細胞的生長狀態及活化表型的影響

王琦 趙佳 陳大方 何曉巖 陳萍 劉慧 洪藝揚 沈筱蕓

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一種從茶葉中提取的水溶性單體，具有明顯的抗氧化、抗炎癥、抗纖維化和抗肝癌作用[1-4]。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）不僅是全肝非實質細胞中占比近30%的基質細胞，也是肝臟中最主要的免疫細胞之一。活化的HSC是產生細胞外基質的主要場所，也是各種致纖維化因素作用的主要效應靶細胞，參與肝組織纖維化過程；HSC還具有抗原提呈細胞的活性，參與免疫調節過程。正常情況下HSC處于靜止狀態[5]。當肝臟有炎癥或受到機械刺激等損傷時，HSC被激活，其表型由靜止型轉變為激活型，并且細胞膜表面表達活化標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。鑒于活化的HSC在EGCG抗纖維化作用機制中所扮演的角色尚不明確，筆者初步研究了EGCG對體外培養的人肝星狀細胞株（LX-2）細胞的生長狀態及活化表型的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 LX-2購自中南大學湘雅醫學院細胞室，實時無標記細胞分析技術（RTCA）系統由杭州艾森生物有限公司提供；DMEM培養基、FBS、青霉素和鏈霉素雙抗購自美國CellMax公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；PBS購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；純度95%EGCG購自美國Sigma-Aldrich公司；α-SMA-Alexa Fluor 405流式抗體購自美國Life Technologies公司；細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-PE/7-AAD）購自美國BD PharmingenTM公司；活細胞/凋亡細胞/壞死細胞鑒別試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；CO2培養箱Heal Force HF90/HF240購自上海力申科學儀器有限公司；離心機Heraeus Multifuge X1R購自美國Thermo Fisher Scientific公司；普通倒置顯微鏡ZEISS primovert、熒光倒置顯微鏡ZEISS AXIO Observer A1購自德國Carl Zeiss Jena公司；流式細胞計數儀LSRFortessaTM購自美國BD公司。

1.2 細胞培養 將LX-2細胞置于含10%FBS和110g/L濃度丙酮酸鈉的高糖DMEM培養液中培養，放于5%CO2和37℃恒溫培養箱中，每2～3d傳代1次，最多5次，顯微鏡下觀察細胞未發生形態學變化。

1.3 EGCG對LX-2細胞生長影響監測 將LX-2細胞體外培養至對數生長期，經胰酶消化后，采用完全培養基終止反應，PBS洗滌、離心、重懸后作細胞計數。將LX-2細胞混懸液接種于RTCA系統的E-Plate 16孔板中（每孔總體積 150μl，含 8×103個細胞），放入細胞培養箱中的RTCA S16上，啟動監測系統，每5min記錄1次監測結果。待細胞增長至對數生長期（約18 h）時暫停監測，將E-Plate 16孔板取出，分別加入終濃度為0、25、50、75、100、125、150、175μmol/L 的 EGCG，并設重復孔。重新將E-Plate 16孔板放回培養箱中的RTCA S16上，每15min監測1次細胞活力和增殖情況，持續監測72h（總監測時間可長達200h）。通過RTCA系統動力學變化反應曲線反映各孔0～90h間LX-2細胞的生長狀況。監測結果顯示為標準化細胞指數（cell index，CI）。通過RTCA Data Analysis Software 1.0軟件分析上述不同濃度EGCG作用至72h的CI值，生成增殖曲線和斜率，其中，增殖曲線可以直觀反映不同濃度梯度的藥物在連續作用至最后檢測時間點時的細胞生長狀態，斜率可以間接反映某一時間段細胞的增殖速率，斜率越大，細胞增殖速度越快，斜率越小，細胞增殖速度越慢；隨著監測時間延長，各組斜率逐漸減小接近0軸，說明細胞增殖速率逐漸減慢至不再增殖，斜率負值表示細胞不僅不再增殖，且發生了明顯的凋亡，呈負增長狀態。

1.4 LX-2細胞凋亡率檢測 取對數生長期LX-2細胞，將LX-2細胞混懸液接種于6孔板（每孔總體積2ml，含3×105個細胞），置于細胞培養箱 6h后，加入終濃度為0、25、50μmol/L的EGCG，分別繼續培養48和72h后，胰酶消化，完全培養基終止消化，收集細胞至15ml離心管。用預冷的PBS洗滌2次，離心，棄上清液，1×Binding Buffer重懸細胞后調整成濃度為1×106個/ml的細胞懸液，取100μl/管細胞懸液至5ml流式管，每管分別加入5μl AnnexinV-PE和5μl 7-AAD，充分混勻后室溫避光孵育15min，最后每管再加入400μl 1×Binding Buffer，充分混勻后在1h內上流式細胞儀檢測。每組做3個復孔，重復實驗3次。實驗結果采用Flowjo 7.6流式專業分析軟件分析，設十字門四象限顯示各類細胞各自占總細胞的比率（%），分別為：活細胞率（Q4）、早期細胞凋亡率（Q3）、晚期細胞凋亡率（Q2）、壞死細胞率（Q1），其中細胞總凋亡率＝Q3+Q2。

1.5 α-SMA表達檢測 取對數生長期LX-2細胞，按1.4方法處理細胞后，收集細胞至15ml離心管，PBS洗滌1次，離心，棄上清液。每管加入4%多聚甲醛500μl于4℃中固定10min，PBS洗滌、離心、棄上清液，加入0.1%Triton X-100/PBS，室溫孵育15min，PBS洗滌、離心、棄上清液，再加入10%羊血清/PBS，室溫孵育1h，再次PBS洗滌、離心、棄上清液后取適量PBS重懸細胞，將細胞懸液移至流式管，每管分別加入5μl流式抗體α-SMA-Alexsa Fluor 405室溫避光孵育30min，最后PBS洗滌、離心、棄上清液，每管加入200μlPBS重懸細胞后上流式細胞儀檢測α-SMA表達。實驗結果采用Flowjo 7.6流式專業分析軟件分析，采用熒光素Alexsa Fluor 405的平均熒光強度值來反映α-SMA的表達強弱程度。每組作3個復孔，重復實驗3次。

1.6 細胞凋亡形態觀察 采用吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）染色法。AO能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發出明亮的綠色熒光；EB僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入細胞核DNA，發出橘紅色熒光。凋亡細胞呈現為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結構；非凋亡細胞核呈現熒光深淺不一的結構樣特征，兩者形態明顯不同。在熒光顯微鏡下觀察，可見4種細胞形態：活細胞，核染色質著綠色并呈正常結構；早期凋亡細胞，核染色質著綠色呈固縮狀或圓珠狀；非凋亡的死亡細胞，核染色質著橘紅色并呈正常結構；晚期凋亡細胞，核染色質為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。

1.7 統計學處理 采用Graphpad Prism 6.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGCG對LX-2細胞生長狀態的影響 加入EGCG后，LX-2細胞的增殖曲線整體下移，且呈藥物濃度依賴性梯度變化，其中增殖曲線中最早且最急劇的下降時間為加入EGCG 3h后，表明EGCG作用3h后的LX-2細胞的生長開始受抑制，見圖1。此外，EGCG作用時間越長，細胞增殖抑制作用越明顯，EGCG濃度越高，細胞增殖抑制作用越明顯，見圖2。

圖1 RTCA實時監控不同濃度EGCG對LX-2細胞的生長狀態的影響

圖2 RTCA實時監控不同濃度EGCG對LX-2細胞增殖速率的作用

2.2 不同濃度EGCG作用后LX-2細胞凋亡率比較 根據上述RTCA藥物細胞監測結果，筆者選擇0、25、50μmol/L這3個濃度EGCG進行后續研究，通過AnnexinV-PE/7-AAD雙染法標記細胞，采用流式細胞儀檢測不同濃度EGCG作用48和72h后LX-2細胞的凋亡率。結果顯示，0、25、50μmol/L的EGCG作用48h后，細胞總凋亡率組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而EGCG 作用 72h后，25μmol/L和 50μmol/L組的細胞總凋亡率與0μmol/L組相比，差異均有統計學意義（均P＜0.05），50μmol/L組的細胞總凋亡率也明顯高于25μmol/L組（P＜0.01）；細胞總凋亡率的組間差異是由早期凋亡變化引起，晚期凋亡差異無統計學意義。結果提示，EGCG可能通過誘導細胞發生凋亡的方式來抑制細胞增殖，見圖3。

2.3 EGCG作用后LX-2細胞α-SMA的表達 不同濃度 EGCG作用 48或 72h后，25μmol/L和 50μmol/L組的α-SMA平均熒光強度均明顯低于0μmol/L，差異有統計學意義（均P＜0.01），25μmol/L與 50μmol/L組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果說明，EGCG可以抑制LX-2細胞的活化標志物α-SMA的表達，且作用時間越久，抑制效果更明顯，見圖4。

圖3 不同濃度EGCG作用后LX-2細胞的流式細胞圖和凋亡率比較（a：干預48、72h后的流式細胞圖；b：不同濃度 EGCG作用48和72h后的LX-2細胞總凋亡率比較；c：不同濃度EGCG作用72h后的 Q2與 Q3比較；與 0μmol/L 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 25μmol/L組比較，△△P＜0.01，nsP ＞0.05）

圖4 流式檢測EGCG作用后LX-2細胞α-SMA的表達（與0μmol/L 組比較，**P＜0.01）

圖5 EGCG作用后熒光顯微鏡下所見（AO/EB染色，×50）

2.4 各組細胞凋亡形態比較 EGCG作用48h，與0μmol/L組比較，25、50μmol/L組的活細胞生長密度降低，橘紅色的凋亡細胞增多；EGCG作用72 h，與0μmol/L組比較，25、50μmol/L組活細胞生長密度更低，橘紅色的凋亡細胞明顯增多。說明EGCG濃度越高，作用時間越長，抑制細胞增殖和誘導凋亡的作用越明顯，見圖5（插頁）。

3 討論

HSC是1種位于肝臟竇周間隙Disse腔內的非實質細胞，這種細胞呈星狀細胞形態，細胞中富含維生素A和脂質小滴，其細胞突起與肝臟內的自主神經末梢相連，能將肝內自主神經沖動傳遞給肝實質細胞。HSC有靜息和活化兩種狀態，正常情況下肝星狀細胞呈靜息狀態，在肝臟中主要參與維生素A的代謝、儲存脂肪、調節血管和肝竇血流。當肝臟受到物理、化學及病毒感染生物因素的刺激時，處于靜息狀態的HSC就會被激活，胞體增大，胞突伸展，胞質中脂滴消失，維生素A含量減少，發生增殖并轉變為“肌成纖維細胞”[6]。自1876年Kupffer意外發現并命名為HSC以來，聚焦HSC的研究結果一致認為，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是肝纖維化發生發展過程中的主要介質，而持續活化的HSC是肝纖維化中ECM的主要來源。活化的HSC能表達活化標志物α-SMA、波形蛋白和結蛋白，并通過增生和分泌ECM參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建；同時通過自分泌轉化生長因子-β、血小板衍生生長因子、內皮素-1等細胞因子使自身活化持續進行。此外，HSC還能促使肝竇內皮細胞收縮使肝竇內壓升高[7]。因此，抑制星狀細胞的活化和減少纖維化介質ECM的分泌一直是抗纖維化治療的主要策略。

EGCG被認為是綠茶多酚的主要的活性成分。EGCG是1種有效的抗氧化劑，因其在預防氧化應激相關疾病（包括癌癥，心血管疾病和纖維化）中的作用而備受關注[8-10]。其中1項有關EGCG在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的研究中，觀察到EGCG與阿托伐他汀（ATST）有相似的功效，并通過EGCG和ATST治療組的RNA微陣列數據的整合生物信息學分析發現，纖維化相關基因如Ⅰ型膠原 1、Ⅰ型膠原 2、Ⅲ型膠原1和Ⅵ型膠原3都出現明顯下調，證明EGCG確實有抑制肝纖維化的功效[11]。有學者研究過EGCG對體外培養的大鼠HSC侵襲和遷移的影響[12]。為了進一步了解EGCG對肝纖維化的抑制作用，筆者研究ECGC對LX-2細胞生長狀態及活化表型的影響。利用RTCA系統連續監測72h不同濃度EGCG對LX-2細胞生長狀態的影響，結果顯示EGCG作用時間越長，細胞增殖抑制作用越明顯，EGCG濃度越高，細胞增殖抑制作用越明顯；而通過流式細胞術和倒置熒光顯微鏡均得到進一步驗證，EGCG能通過誘導凋亡的方式抑制LX-2細胞的增殖和活化。

本研究不僅通過RTCA動態監測技術明確了EGCG對人肝星狀細胞株的藥物毒性反應，也通過熒光染色利用不同的檢測技術明確了EGCG作用后的LX-2細胞生長狀態和活化標志α-SMA的影響，為EGCG抗肝纖維化的藥物活性和機制研究提供更具體的實驗數據。來自單細胞基因和蛋白質調節研究的最新結果開始揭示先前未被充分認識的HSC功能表型，該研究通過開發相關的數學模型，描述了HSC功能表型對肝臟再生的貢獻，并通過單個HSC的分離和轉錄表征的測試模型，將HSC功能表型的分布動態變化與嚴格調節的肝再生生理反應相關聯。結果鑒定出導致肝再生的4種HSC轉錄狀態（其中兩種為首次報道的轉錄狀態），并揭示了不同轉錄狀態的HSC表型之間的差異及這些表型的動態轉換如何控制肝再生的過程[13]。這為筆者的下一步研究帶來啟示，利用EGCG對HSC的抑制作用，除了能起到抗纖維化功效，是否還能干預不同HSC表型對肝再生的調控，成為抗肝纖維化和誘導肝再生的利器。