抗結核急性藥物性肝損傷患者GCLM、GCLC和GSTP1基因多態性的關系

王赟 鮑靖

肺結核是我國常見的傳染病之一，臨床常采用多種抗結核藥物治療，但患者易出現抗結核急性藥物性肝損傷(anti-tuberculosis acute drug-induced liver injury，AADLI)，嚴重時可導致患者出現急性肝衰竭甚至死亡[1]。目前關于AADLI的誘因尚未完全清楚，有研究認為與藥物毒性代謝酶及轉運蛋白等的基因多態性有關[2]。谷氨酰半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)基因C-588T位點多態性可影響GCLM活性進而參與多種生理病理過程[3]，谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)T-129C位點可通過影響抗氧化物水平進而參與慢阻肺疾病發生及發展過程[4]，谷胱甘肽S轉移酶P1(GSTP1)可促使親電子物質與谷胱甘肽繼而與親脂性細胞毒藥物結合并降低藥物作用[5]。本研究主要探討GCLM、GCLC、GSTP1基因多態性與AADLI的關系，為臨床用藥和降低肝損傷發生率提供參考。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年6月至2017年2月在青海省第四人民醫院確診為肺結核患者178例，所有肺結核患者均符合診斷標準[6]。出現抗結核急性藥物性肝損傷患者92例為研究組，均符合抗結核藥物性肝損傷診斷標準[7]，其中男68例，女24例，年齡42～68歲，平均(49.2±15.8)歲。未出現抗結核急性藥物性肝損傷患者86例為對照組，其中男56例，女30例，年齡41～70歲，平均(48.7±16.6)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：①抗結核治療不少于6個月；②均使用相同抗結核治療方案；③無服用其他可引起肝功能異常藥品；④臨床資料完整；⑤患者知情且簽署同意書。排除標準：①其他原因所致肝功能嚴重損傷；②病毒性肝炎或酒精性肝炎；③自身免疫性疾病；④患者依從性差；⑤多種組織器官缺氧性損傷。

二、方法

采集受試者靜脈血3 mL置于EP抗凝管內，2 000 r/min離心3 min，加入紅細胞裂解液混勻，-20 ℃保存。提取基因組DNA并采用限制性片段長度多肽法(RFLP)進行檢測，DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技公司)提取全血基因組DNA，GCLM、GCLC、GSTP1基因分型采用PCR結合RFLP方法并運用Sequenom軟件進行SNP基因分型(Nano Drop2000c核酸檢測儀購于美國Thermo公司，PCR擴增儀購自美國BioRad公司)，GCLM基因T-588C、GCLC基因C-129T位點T、GSTP1基因Ile105Val位點PCR擴增、單堿基延伸引物由廣州Invitrogen公司合成。PCR反應體系共50 μl，Taq Buffer 5 μl，MgCl23 μl，位點T、G(A、C)引物上下游各2 μl，dNTP Mix 1 μl，DNA樣本4 μl,Taq DNA 0.5 μl，H2O 28.5 μl。PCR反應條件為95℃ 53 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環，72℃延伸7 min。取PCR產物5 μl并加入20 μl酶切反應體系，進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察電泳條帶，各基因型判斷參照相關文獻[8]，回收PCR產物經上海生工生物公司進行序列測定。GCLM基因T-588C位點：①野生型CC型，兩條DNA條帶，200 bp、84 bp；②突變雜合子CT型，兩條DNA條帶，200 bp、129 bp；③突變純合子TT型，一條DNA條帶，129 bp。GCLC基因C-129T位點：①野生型純合子TT型，一條DNA條帶，163 bp；②突變雜合子CT型，兩條DNA條帶，163 bp、137 bp；③突變純合子CC型，一條DNA條帶，137 bp。GSTP1基因Ile105Val位點：①野生型純合子AA型，一條DNA條帶，452 bp；②突變雜合子AG型，兩條DNA條帶，452 bp、222 bp；③突變純合子GG型，兩條DNA條帶，230 bp、222 bp。

三、觀察指標

ALT、AST、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、TBil、白蛋白、血清C反應蛋白(CRP)。

四、統計學方法

結 果

一、兩組一般資料比較

研究組ALT、AST、γ-GT、TBil與CRP水平均顯著高于對照組(P<0.05)，而白蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 2組患者肝功能指標比較(±s)

二、GCLM、GCLC與GSTP1基因分型

GCLM、GCLC與GSTP1電泳條帶結果見圖1。GCLM基因T-588C位點存在單核苷酸多態性即C→T，CC為野生型、CT為突變雜合子、TT為突變純合子；GCLC基因C-129T位點存在單核苷酸多態性即T→C，TT為野生型、CT為突變雜合子、CC為突變純合子；GSTP1基因Ile105Val位點存在單核苷酸多態性即A→G，AA為野生型、AG為突變雜合子、GG為突變純合子。

注：1-3分別為GCLM基因T-588C位點CC、CT、TT基因型；4-6分別為GCLC基因C-129T位點TT、CT、CC基因型；7-9分別為GSTP1基因Ile105Val位點AA、AG、GG基因型

三、Hardy-Weinberg遺傳平衡驗證

研究組與對照組Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗結果顯示GCLM、GCLC與GSTP1基因位點實際值與預測值比較無明顯差異(P>0.05)，且各基因型頻率穩定，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，見表2。

四、AADLI與GCLM、GCLC、GSTP1基因多態性及其相關因素的Logistic分析

將影響AADLI發生的影響因素與GCLM、GCLC、GSTP1基因多態性進行Logistic分析，結果顯示γ-GT、CRP水平及GCLM基因T-588C位點TT、GCLC基因C-129T位點CC、GSTP1基因Ile105Val位點GG基因型均為AADLI發生的危險因素，見表3。

討 論

藥物性肝損傷主要是由于抗結核治療藥物及其代謝產物對肝細胞代謝產生干擾作用，并對肝細胞產生毒性及免疫變態反應，同時可對患者抗氧化應激能力產生重要影響，嚴重時可導致患者出現AADLI甚至危及生命[9]。研究發現HBV攜帶者發生藥物性肝損傷的概率更高，并促使藥物清除率降低進而加劇藥物毒性反應[10]。近年來抗結核藥物所致肝損傷已成為我國AADLI發生的主要因素，及時干預是減少其發生的關鍵[11]。

表2 GCLM、GCLC、GSTP1基因型頻率實際值與預測值的比較 [例(%)]

注：a為研究組比較；b為對照組比較

表3 AADLI與GCLM、GCLC、GSTP1基因多態性及其相關因素的Logistic分析

谷胱甘肽(GSH)可調節細胞氧化還原狀態進而降低機體氧化損傷程度，而谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)為GSH的限速酶并對其合成過程產生重要作用[12]。GCL主要由GCLC與GCLM組成，其中GCLC具有催化活性而GCLM具有調節功能[13]。研究表明GCLC與GCLM基因單核苷酸多態性改變可調控基因表達過程從而參與多種疾病的發生過程[14]。GCLM(T-588C)突變基因型可決定啟動子活性，并與慢性阻塞性肺疾病易感性密切相關[15]。GCLC(C-129T)突變基因可通過改變核蛋白結合域構象并阻礙氧化應激或免疫反應等元件與其結合進而抑制GCLC基因表達，同時可減少GSH生成并削弱細胞抗氧化應激或免疫能力最終增加發病風險[16]。本研究結果顯示，GCLM、GCLC基因位點實際值與預測值比較無明顯差異且各基因型頻率穩定，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，GCLM基因T-588C位點C→T，GCLC基因C-129T位點T→C。進一步分析發現研究組與對照組GCLM基因T-588C位點TT基因型分布比較差異顯著，GCLC基因C-129T位點CC基因型分布比較差異顯著，說明GCLM基因T-588C位點TT基因型與GCLC基因C-129T位點CC基因型可抑制GCLM及GCLC基因表達并參與AADLI發生過程，提示GCLM與GCLC基因多態性可通過調控相關基因表達，并影響GSH生成進而調節機體氧化應激反應等生理病理過程，最終影響AADLI發生及發展。

谷胱甘肽S轉移酶(GST)是人體內一種重要的Ⅱ相藥物代謝酶且屬于解毒酶系，其基因多態性可通過改變酶分子結構、功能及表達水平從而影響細胞解毒能力，其與腫瘤易感性密切相關[17]。GSTP1基因定位于人類染色體11q13，GSTP1基因Vall05位點A→G突變可影響GSTP1酶活性并與非小細胞癌藥物化療效果有關[18]。GSTP1 Ile105Val位點單核苷酸多態性與肺癌、乳腺癌等易感性密切相關并可影響多種化療藥物敏感性[19]。本研究結果顯示，GSTP1基因Ile105Val位點主要以AA純合子為主，突變純合子GG基因型較少，但僅GG基因型在研究組與對照組中分布差異顯著，與文獻報道相似[20]。說明GSTP1 Ile105Val基因型突變可影響肺結核患者發生AADLI，提示攜帶GG基因型肺結核患者發生AADLI危險性增加。多因素Logistic回歸分析結果顯示，γ-GT、CRP水平及GCLM基因T-588C位點TT基因型、GCLC基因C-129T位點CC基因型、GSTP1基因Ile105Val位點GG基因型均為AADLI發生的危險因素。本研究結果揭示GCLM基因T-588C、GCLC基因C-129T及GSTP1基因Ile105Val位點突變會影響GSH與GCL活性，降低代謝藥物能力，進而增加AADLI患者易感性。

綜上所述，GCLM、GCLC與GSTP1基因多態性與AADLI發生密切相關，可能作為早期AADLI發病風險的重要指標，但其在AADLI發病過程中的具體作用機制有待深入研究。