SRPX2對肝癌細胞侵襲與遷移能力的影響及作用機制

王云檢 尤國華 張珉 張璐陽

肝癌術后復發轉移率超過60%，成為肝癌患者死亡的主要原因[1]。侵襲與遷移是肝癌的基本特征，細胞侵襲與遷移取決于細胞黏附以及細胞外蛋白水解變性[2]。肝癌細胞可以在趨化因子刺激下發生運動，但其黏附性程度下降，容易從原發灶脫離并降解細胞外基質，形成向外轉移的通道，促進腫瘤細胞的侵襲、遷移[3]。sushi重復蛋白X連鎖2(sushi repeat containing protein x linked 2，SRPX2)是一種硫酸軟骨素蛋白聚糖，與腫瘤的侵襲與遷移密切相關[4]。研究發現，當SRPX2的表達受到抑制，可以減緩肝癌細胞的侵襲與遷移[5]。因此，通過研究SRPX2對人肝癌細胞MHCC97H侵襲與遷移能力的影響及作用機制，為SRPX2成為肝癌治療靶點提供一定依據。

資料和方法

一、主要試劑與儀器

人肝癌細胞MHCC97H(中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫，中國)、SRPX2特異性siRNA和陰性對照(negative control，NC)(上海吉瑪生物科技有限公司，中國)。DMEM 培養基、胰酶(Gibco公司，美國)、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司，中國)。Trizol Reagent RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒(大連Takara公司，中國)、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，中國)。PCR引物序列(大連Takara公司，中國)為SRPX2引物序列：上游引物為5′-ACTGGATTTGCGGCATGTGA-3′，下游引物為：5′-CCATGTTGAAGTAGGAGCG-AGTGA-3′；MMP-2引物序列：上游引物為5′-AGACATACATCTTTGCTGGAGACA-3′，下游引物為：5′-CTTGAAGAAGTAGCTGTGACCG-3′；GAPDH引物序列：上游引物為5′-TCCCATCACC-ATCTTCCAG-3′，下游引物為：5′- GGTATCC-ATCGCCATGCTC -3′。細胞蛋白抽提試劑(碧云天生物技術研究所，中國)、鼠抗SRPX2、MMP-2(Santa Cruz公司，美國)、辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗、鼠抗GADPH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司，中國)。凝膠成像儀(美國 UVP 公司)、ECL 顯影液(美國 Millipore 公司) 。CO2細胞培養箱 (Thermo Revco，美國)、24孔Transwell小室(CORNING科技有限公司，美國)。NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(Thermo公司，美國)、實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司，美國)、倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)、基質膠、BIO-RAD 垂直電泳儀(BD公司，美國)、凝膠成像儀( UVP 公司，美國) 。

二、細胞培養及轉染

用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養人肝癌細胞MHCC97H，條件為37℃、5% CO2，隔天換液，當人肝癌細胞HepG2處于對數生長期時進行實驗。實驗分為空白對照組、陰性對照組和干擾SRPX2組。空白對照組在鋪板后48 h收獲細胞，陰性對照組和干擾SRPX2組分別用Lipofectamine法將NC和SRPX2特異性siRNA轉染到人肝細胞癌MHCC97H，繼續培養48 h收獲細胞，進行相關檢測。

三、細胞體外侵襲和遷移能力實驗

按照細胞分組分別處理24 h后對細胞進行消化，用基質膠檢測侵襲能力和不鋪基質膠檢測遷移能力。將消化獲得細胞調整濃度為5×105后接種在24孔Transwell小室中，每孔200 μl，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養液，繼續培養24 h，取出小室，用無菌棉簽擦拭去除上室內的細胞，用4%甲醛固定10 min，用0.1%結晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后倒置顯微鏡下觀察細胞，拍照。計數紫色染色的穿膜細胞，即細胞侵襲和遷移能力。各劑量組設3個平行樣。

四、實時熒光RT-PCR檢測SRPX2和MMP-2 mRNA的表達

按照細胞分組分別處理48 h后對細胞進行消化，消化后取5 mL細胞液(細胞濃度為5×106/mL)，5000 r/min、5 min離心，根據RNA提取試劑盒操作說明書進行總 RNA提取，測定mRNA濃度和純度，將提取的總RNA根據反轉錄試劑盒說明合成cDNA，根據SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ熒光定量PCR試劑盒說明，用制備20 μl反應體系，在CFX-96 PCR擴增儀中進行擴增。反應條件為預變性95℃ 30 s、 變性 95℃ 5 s、60℃ 44 s、40個循環，61 ℃時采集熒光，用實時熒光定量 PCR儀檢測對其表達量進行結果分析，以GADPH作為內參，采用 2-△△Ct法計算 SRPX2和MMP-2 mRNA 的相對表達量。各劑量組設3個平行樣。

五、Western Blot法檢測SRPX2和MMP-2蛋白水平

按照細胞分組分別處理48 h后對細胞進行消化，消化后加2 ml無血清培養基終止消化，5 000 r/min、5 min離心，洗滌2次，加入1 μl PMSF，根據細胞量加入胞蛋白抽提液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，進行蛋白定量；調整蛋白濃度，加入1/5體積的5×緩沖液，沸水進行變性，-80℃保存備用。采用 BIO-RAD 濕轉系統SDS-PAGE 膠進行電泳、切膠；孵育一抗、 4℃下孵育相應條帶過夜、孵育相對于二抗，于暗室內用ECL 法發光觀察蛋白表達，采集圖像，用凝膠成像儀對免疫印跡條帶灰度值進行分析，計算目的蛋白與內參蛋白條帶的灰度值比值。各劑量組設3個平行樣。

六、統計學分析

結 果

一、Transwell侵襲和遷移實驗檢測人肝癌細胞MHCC97H侵襲和遷移能力變化

由圖1～2可見陰性對照組MHCC97H侵襲和遷移能力與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，干擾SRPX2組人肝癌細胞MHCC97H侵襲和遷移能力較陰性對照組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 人肝癌細胞MHCC97H侵襲情況

圖2 人肝癌細胞MHCC97H遷移情況

二、人肝癌細胞MHCC97H內SRPX2和MMP-2 mRNA表達的影響

由表1可見陰性對照組人肝癌細胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 mRNA相對表達量較空白對照組比較降低不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)，干擾SRPX2組人肝癌細胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 mRNA相對表達量較陰性對照組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 人肝癌細胞MHCC97H內SRPX2和MMP-2 mRNA表達的影響(±s)

注：*表示與空白對照組相比差異有統計學意義，P<0.05；#與陰性對照組相比差異有統計學意義，P<0.05

三、人肝癌細胞MHCC97H內SRPX2和MMP-2蛋白表達的影響

由圖3可見陰性對照組人肝癌細胞MHCC97H SRPX2和MMP-2蛋白表達量較空白對照組降低不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)，干擾SRPX2組人肝癌細胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 蛋白表達量較陰性對照組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

A:空白對照組、B:陰性對照組、C:干擾SRPX2組

討 論

SRPX2最先在癌細胞中被發現，隨著研究的深入，發現在正常組織中均有低表達[6]。在對結腸癌的研究中發現，SRPX2在癌癥組織中高表達，且與患者的不良預后密切相關，提示SRPX2 蛋白在癌癥組織中高表達[7]。SRPX2可以和組織蛋白酶B、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等結合，影響細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白的水解,而 ECM 結構的改變是影響細胞侵襲遷移的重要因素之一[7]。RNA 干擾(RNAinterference,RNAi)是基因轉錄后沉默的重要機制之一，通過破壞靶基因的mRNA使其基因不表達，siRNA是RNAi的效應分子。本研究發現，通過將SRPX2特異性siRNA干擾片段轉入人肝癌細胞MHCC97H后，SRPX2 mRNA和蛋白的表達量都降低，同時使MMP-2 mRNA和蛋白的表達量也降低。MMP2是MMP家族的重要一員，MMP家族成員幾乎都能降解ECM中的各種蛋白成分，MMP-2基因5′旁側序列促進子區域含有2個GC盒，活化的MMP-2定位于細胞穿透基質的突出部位，在酶解細胞間基質成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用，是ECM代謝過程中最主要的蛋白水解酶類。在裸鼠肝癌模型的研究發現，MMP-2的表達量增加可以影響肝癌細胞的輕型遷移能力，增加了肝癌細胞向裸鼠肺部轉移的機會；同時，門靜脈受到侵犯是肝癌發生轉移的重要環節，MMP-2可以破壞狄氏間隙的網狀結構，為肝癌細胞的遷移創造了條件[8]。本研究發現，通過干擾SRPX2表達，進而使MMP-2的表達降低，人肝癌細胞MHCC97H侵襲和遷移能力降低。

綜上所述，SRPX2與肝癌細胞的侵襲遷移密切相關，SRPX2的表達降低，MMP2的表達也隨之降低，其侵襲遷移能力也明顯下降，SRPX2可能通過調節MMP2而影響人肝癌細胞MHCC97H侵襲和遷移，為肝癌靶向治療提供一定的理論依據。