分子印跡電化學傳感器檢測鏈霉素

何雪麗，李云倩，宋雨瑩，呂曉芳，張蒙，廉文靜

（天津農學院 基礎科學學院，天津 300384）

鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，對革蘭氏陰性細菌具有殺滅作用[1-2]。近年來，鏈霉素作為抗菌藥物被廣泛應用于農業及畜牧業中[3]。長期攝入含有超量鏈霉素的食品對人體有嚴重的副作用，如:過敏反應、腎毒性、耳毒性等[4]。因此，探索快速、靈敏檢測鏈霉素的方法具有非常重要的研究意義和應用價值。

電化學分析方法具有檢測靈敏度高、簡單快速、成本低等優點，因而被廣泛應用于各類物質的分析檢測中。分子印跡技術模擬自然界中天然分子識別系統的特異性識別作用，具有特異性強、穩定性高等優點[5]。近年來，將分子印跡技術與電化學分析方法結合構建分子印跡電化學傳感器已成為一種非常有前景的分析方法[6]。

本研究結合分子印跡技術與電化學檢測方法的優點，以鏈霉素為模板分子，吡咯為功能單體，利用簡單電聚合方法制備特異識別鏈霉素的分子印跡聚合物（MIP） 膜，構建鏈霉素分子印跡電化學傳感器。通過對傳感器測定條件優化選擇，實現鏈霉素的快速、靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器:CHI660E型電化學工作站；三電極系統（鉑絲對電極，飽和甘汞參比電極，金工作電極）；BSA223S型電子天平；KH5200B型超聲波清洗儀；HWCL-3型恒溫磁力攪拌器。

試劑:硫酸鏈霉素、硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、紅霉素、吡咯（購于阿拉丁試劑有限公司）；氯化鈉、氫氧化鈉（購于天津市風船化學試劑有限公司）；鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（購于北京化工廠），以上試劑均為分析純。拋光氧化鋁粉（購于天津艾達恒晟科技有限公司），牛奶樣品購于本地市場，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 金電極預處理

將金電極依次用1 μm、0.3 μm和50 nm粒徑的氧化鋁粉拋光處理，然后將處理后的金電極置于蒸餾水中超聲震蕩30 s，得到表面光潔的金電極。

1.3 鏈霉素分子印跡傳感器的制備

將三電極系統置于含有10 mmol/L鏈霉素和30 mmol/L吡咯的pH 6.8的磷酸緩沖液中，利用循環伏安（CV）法在金電極表面電聚合得到MIP膜（掃速0.05 V/s，聚合電位為0～1.4 V，聚合圈數為5圈）。將電聚合后的MIP薄膜電極室溫晾干后，置于0.1 mol/L氫氧化鈉洗脫液中磁力攪拌15 min除去模板分子鏈霉素，得到對鏈霉素具有特異識別作用的洗脫后的MIP薄膜電極。

1.4 電化學檢測

采用三電極系統利用CV法在含有5 mmol/L鐵氰化鉀和0.5 mol/L氯化鉀的水溶液中進行電化學檢測（掃速0.05 V/s，掃描電位為0.2～0.6 V，掃描圈數為3圈，選擇第3圈穩定數據作為測定結果）。所有電化學檢測實驗均在室溫條件進行。

1.5 實際樣品制備

實際牛奶樣品從當地市場購得，按照牛奶樣品與蒸餾水體積比為1∶4的比例對牛奶樣品進行稀釋，然后利用無菌微孔過濾膜（0.22 μm） 將稀釋后的牛奶樣品過濾。

2 結果與討論

2.1 傳感器構建過程的循環伏安表征

以鐵氰化鉀為探針，采用三電極系統利用CV法在含有5 mmol/L鐵氰化鉀和0.5 mol/L氯化鉀的水溶液中對傳感器構建過程進行表征。測定結果如圖1所示。裸金電極的CV曲線有一對可逆的氧化還原峰（曲線a）。當在金電極表面電聚合一層MIP膜后，電極的氧化還原峰電流明顯降低（曲線b），這是因為電聚合后在金電極表面形成的緊密MIP膜阻礙了鐵氰化鉀探針在電極表面的電化學反應。當利用洗脫劑洗脫掉模板分子鏈霉素后，電極的電流響應明顯增強（曲線c），這是由于洗脫后，MIP膜表面很有很多鏈霉素的識別位點，MIP膜變成多孔結構，有助于鐵氰化鉀探針穿過孔穴到達電極表面，發生電化學反應。將洗脫后的電極置于1.00×10-5mol/L鏈霉素溶液中進行重結合，發現重結合后，電極的電流響應明顯降低（曲線d），這是因為重結合后，MIP膜上鏈霉素的特異性識別位點重新被占據，MIP膜上的立體孔穴數量明顯變少，阻礙了鐵氰化鉀的電化學反應。CV表征表明:構建的鏈霉素分子印跡電化學傳感器對鏈霉素具有識別作用，可以利用洗脫及重結合后電極的氧化峰電流差值ΔIpa與鏈霉素濃度c之間的關系對被測鏈霉素進行定量分析。

2.2 測定條件優化

在分子印跡電化學傳感器構建過程中，模板分子與功能單體的比例、電聚合圈數、洗脫時間及重結合時間對傳感器的穩定性和分析性能有很大的影響。因此，本研究利用CV表征對傳感器的構建及測定條件進行了優化選擇，經優化發現:模板分子與功能單體的摩爾比為1∶3，電聚合圈數為5圈，洗脫時間和重結合時間均為15 min時，傳感器的電流響應最大，穩定性和檢測靈敏度最強。

圖1 傳感器構建過程循環伏安圖，

2.3 校準曲線的繪制

在最優化條件下，用該傳感器測定5.00×10-9～1.00×10-3mol/L濃度的鏈霉素，先測定鐵氰化鉀探針溶液在洗脫后電極上的CV氧化峰電流Ipa1，然后將洗脫后的電極浸入到不同濃度鏈霉素溶液中重結合15 min，測定鐵氰化鉀在重結合后電極上的的CV氧化峰電流Ipa2。

根據鏈霉素濃度c與洗脫及重結合后電極的氧化峰電流差值ΔIpa（ΔIpa=Ipa1-Ipa2）的關系繪制傳感器的校準曲線，如圖2所示。傳感器的線性范圍為 5.00×10-8～8.00×10-5mol/L，線性方程為ΔIpa(A)=6.062 (A)+0.056394c(mol/L)(r=0.996)，LOD 為 3.45×10-8mol/L(S/N=3)。

圖2 傳感器檢測鏈霉素的校準曲線

2.4 傳感器的選擇性、重復性及穩定性研究

選擇性研究:為了研究該傳感器對鏈霉素的特異選擇性，選擇鏈霉素的三種結構類似物（新霉素，慶大霉素，紅霉素）作為干擾物質，利用傳感器對1.00×10-5mol/L鏈霉素及1.00×10-4mol/L新霉素，1.00×10-4mol/L慶大霉素和1.00×10-4mol/L紅霉素進行測定。CV測定結果如圖3所示。傳感器對鏈霉素的電流響應遠大于對三種干擾物質的電流響應，說明該傳感器對鏈霉素具有很強的特異選擇性。

圖3 傳感器的選擇性

重復性研究:利用相同的方法構建5個鏈霉素分子印跡電化學傳感器，并對5.00×10-6mol/L鏈霉素進行測定，5次測定的相對標準偏差（RSD）為3.9%，說明該傳感器具有良好的重復性。

穩定性研究:利用相同的方法構建3個鏈霉素分子印跡電化學傳感器，并對5.00×10-6mol/L鏈霉素進行測定并記錄測定的氧化峰電流值。然后將3個傳感器室溫放置10天后再對5.00×10-6mol/L鏈霉素進行測定，發現測定的氧化峰電流值約為初次測定的93%，說明該傳感器具有良好的儲存穩定性，放置一段時間后，仍然可以用于鏈霉素的測定。

2.5 實際樣品檢測

為了研究該傳感器的實際應用性，利用該傳感器對市售牛奶樣品進行測定，未檢出鏈霉素，說明牛奶樣品中不含鏈霉素或該傳感器靈敏度不夠高，牛奶樣品中鏈霉素含量低于傳感器的LOD。因此，采用加標測定法，在牛奶樣品中加入 3種濃度 （1.00×10-6mol/L,5.00×10-6mol/L,1.00×10-5mol/L） 的鏈霉素后，利用該傳感器對加標后的牛奶樣品進行測定，測定結果如表1所示，回收率為95%～106%，平行樣品測定的RSD為4.3%～5.2% (n=3)，說明該傳感器適用于實際樣品中鏈霉素的定量測定。

3 結論

本研究分別以鏈霉素、吡咯為模板分子、功能單體為樣本，利用簡單電化學聚合方法制備得到對鏈霉素具有特異識別作用的MIP膜。通過對傳感器測定條件優化選擇，得到該傳感器在5.00×10-8～8.00×10-5mol/L 范圍內對鏈霉素呈良好線性，LOD為3.45×10-8mol/L。該傳感器具有良好的選擇性、重復性和再現性，并在實際樣品測定中得到了很好的回收率。該研究為食品中鏈霉素的快速、靈敏分析提供了簡單、高效的方法。

表1 牛奶樣品加標檢測鏈霉素