基于D-SERS法表征兩性霉素B對白色念珠菌抑制作用的研究

范加騰，陸 峰，許激揚

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京，210000)

近20年來，全球真菌感染率急速上升，尤其是深部真菌感染的死亡率高達40%[1-2]，其中，念珠菌是最主要的條件性致病真菌之一。

目前，能夠治療真菌感染的藥物主要有：唑類抗真菌藥物，此類藥物為抑菌劑，僅能抑制白色念珠菌的生長，而不能起到殺菌效果[3-5]。烯丙胺類抗真菌藥物，主要治療淺部真菌感染。棘白菌素類藥物對白色念珠菌具有殺滅作用[6]。而多烯類抗真菌藥物，以其殺菌效果強、治療范圍廣、耐藥菌較少為廣大醫務人員所青睞，本研究以多烯類抗真菌藥物兩性霉素B作為研究對象[7]，來表征該藥物對白色念珠菌的抑制作用。

傳統的用于表征藥物與菌株相互作用的方法非常費時，需要培養菌株以檢測菌株生長或生長行為[8-9]。因此，亟需更加快速、簡便的方法。

動態表面增強拉曼光譜法(D-SERS)，即在納米溶膠從濕態到干態的轉變過程中進行檢測[10-15]。隨著D-SERS的調控條件的優化以及其本身強大的優勢，其應用范圍也越來越廣泛，我們研究小組曾將其成功地應用于相關的藥品快檢[16]和對植物性膳食補充劑中摻雜藥物的高靈敏現場檢測[17]中。因此，筆者決定采用動態增強拉曼光譜法分析藥物與菌株的相互作用，以期建立更加快速、簡便的方法來表征兩性霉素B對白色念珠菌的抑制作用，為后續對微生物菌株的鑒別和分析藥物的作用效果和機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

硝酸銀(AgNO3)、二水合檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、丙酮(C2H6O)、乙醇、雙氧水(30% H2O2)、濃硫酸(H2SO4)、硝酸(HNO3)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸氫鈉(NaHCO3)等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。臨床敏感白色念珠菌311由上海長海醫院皮膚科提供。實驗用水為三蒸水和去離子水。酵母浸膏、葡萄糖(C6H12O6)、蛋白胨、瓊脂、RPMI 1640(Gibco BRL)、嗎啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)購自于探索平臺。對照品兩性霉素B(AMB)、米卡芬凈(MCF)購自于大連美倫生物科技有限公司。

YPD培養液：酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，加900 ml三蒸水溶解定容至1 000 ml。高溫高壓滅菌(121 ℃，15 min)，放于干燥處備用。

沙氏培養基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，加入三蒸水溶解并定容至1 000 ml。121 ℃，15 min高壓蒸汽滅菌。

RPMI 1640培養液：RPMI 1640(Gibco BRL)10 g、NaHCO32.0 g、嗎啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)34.5 g(0.165 mol/L)，加三蒸水900 ml溶解，用1 mol/L NaOH調pH至7.0(25 ℃)。三蒸水定容至1 000 ml，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4 ℃保存備用。

Piranha溶液：30% H2O2與濃硫酸按體積比3∶7稱量，將30% H2O2溶液緩慢加入濃硫酸中，于75 mm培養皿中靜置，冷卻后備用。

1.2 儀器

K-sens拉曼光譜系統(上海復享公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；TG16-WS型高速離心機(上海盧湘離心機有限公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Zeiss EVO MA-10掃描電鏡顯微鏡(德國Carl-Zeiss)；Eppendorf 5417R高速冷凍離心機，(德國Eppendorf)；Zerasizer Nano ZSE納米粒度儀(英國馬爾文)；JEM-2100F 200 kV場發射透射電子顯微鏡(日本JEOL)；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器(美國Scientific Industries)；不銹鋼立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申)；MJX型智能霉菌培養箱(寧波江南儀器廠)；Multiskan MK3酶標分析儀(美國Thermo fisher)；TS-1型脫色搖床(江蘇海門市麒麟醫用儀器廠)。

1.3 增強試劑的制備與表征

本實驗采用經典的Lee法制備納米銀膠[18]。將36 mg的AgNO3溶于200 ml 去離子水中，加熱攪拌至微沸，加入4 ml質量分數1%復溶檸檬酸三鈉水溶液，溶液顏色由無色透明逐漸變成淡黃色，再變為淡灰色并略帶綠色，保持微沸30 min停止反應，水浴冷卻。即得到粒徑約為75 nm的納米銀球，避光保存。取用銀膠溶液時，由于納米銀的制備過程中有微量表面離子干擾，故將配好的納米銀溶液進行表面離子清洗。具體方法為將銀膠溶液以6 500 r/min離心，6 min后除去上清液，以相同體積的去離子水復溶，振蕩搖勻后備用。同時，通過紫外以及掃描電鏡圖對銀膠進行表征。

1.4 細胞培養與MIC80的測定

取-80 ℃冰箱中凍存的臨床白色念珠菌，接種于1 ml YPD培養液中，于30 °C，200 r/min振蕩培養16 h，使白色念珠菌處于指數生長后期，活化2次。劃板并培養于沙氏培養基上，2 d后長至正常菌株大小。待光譜測定前，將白色念珠菌接種于1 ml YPD培養液中，于上述條件下傳代培養16 h。

白色念珠菌的MIC80測定方法為：將傳代好的白色念珠菌用新鮮RPMI 1640培養液稀釋至105CFU，分別加入96孔板，加入相應體積AMB藥物標準品溶液，按照倍比稀釋法，使AMB濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0 μg/ml ，置于30°C培養箱，培養24 h后用酶標儀測定每孔光密度值，并計算相應的MIC80值。

1.5 光譜檢測

為除去硅片表面有機物，需要對硅片進行清洗。首先將硅片放入新配制并放置冷卻的Piranha溶液中浸泡。待取用時，將硅片取出并用大量去離子水進行沖洗，之后分別用丙酮、乙醇、去離子水超聲清洗各1 h，干燥后備用。

考慮菌液中YPD溶液對結果的干擾，故用去離子水對傳代16 h的菌液清洗。具體方法為將菌液以5 000 r/min進行離心4 min，除去上清液，加入等體積去離子水。重復3次確保YPD培養液去除徹底。

將用二甲基亞砜(DMSO)溶解后的兩性霉素B加入到清洗干凈的菌液中，配成藥物濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml的溶液(且DMSO濃度低于2%)，渦旋混勻后放入搖床中，作用時間5、60、120、240 min，將溶液進行離心(5 000 r/min，4 min)，去除上清夜，再加入等體積的去離子水，重復清洗3次。

將清洗后的菌液和納米銀膠混合并渦旋振蕩混勻。取3 μl的混合溶液滴于硅片表面，無需干燥，直接置于拉曼光譜儀下檢測。光譜檢測參數：激光功率100 mW，積分時間5 s，顯微系統放大倍數100。

1.6 數據的預處理

使用Matlab 13.0軟件對光譜數據進行預處理，取光譜波段在550～1 800 cm-1用于光譜分析 (550 cm-1之前有硅片520 cm-1的干擾，而1 800 cm-1后幾乎沒有光譜特征)，后面依次對光譜進行基線校正(airPLS法)，平滑(Sgolay法)以及規范化(Min-Max Normalization)。

2 結果

2.1 MIC80的測定

常用的微量稀釋法作為一種金標準方法，準確性好，測得AMB對白色念珠菌的最小抑菌濃度為1 μg/ml。

2.2 納米銀球的表征

在SERS基底中，最常見的是采用納米銀來增強拉曼信號，而Lee法也成為了最經典的制備方法。在生命科學領域，有不少將納米銀球用于細胞檢測的例子，尤其在微生物的檢測方面。因此，本研究制備納米銀來進行微生物的拉曼信號的增強。圖1為納米銀球的紫外表征和掃描電鏡圖。圖1中可以觀察到納米銀近似球狀，因此在紫外圖中表現出的是一個單峰。納米粒子的分散程度通常可用紫外吸收峰的半峰寬來反映。約為50 nm的半峰寬體現出納米粒子具有良好的分散性，納米銀球排列均勻。

2.3 AMB與白色念珠菌作用的光譜圖

將兩性霉素B溶液加入到清洗干凈的菌液中，配成藥物濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml的溶液，渦旋混勻后放入搖床中孵育5、60、120、240 min，之后將混合液清洗3遍后滴于硅片表面進行檢測。采集到的光譜圖進行基線校正，平滑，歸一化后，選取光譜波段550～1800 cm-1，得到結果如圖2。從圖中可以看出拉曼位移在656 cm-1和729 cm-1處的峰強度最強且變化最為明顯。當藥物濃度比較低甚至為0 μg/ml的時候，656 cm-1處的峰強要高于729 cm-1處的峰強度，隨著藥物濃度逐漸升高，656 cm-1處的峰強逐漸降低，729 cm-1處的峰強逐漸升高。

因此，筆者將考察該兩處拉曼位移峰的峰強比和藥物濃度之間的關系(峰比值法)，來觀察不同濃度的AMB對白色念珠菌拉曼光譜的影響(圖3)。從圖中可以清楚的看出隨著AMB濃度的升高，峰強比迅速下降，當達到一定濃度后峰強比逐漸趨于平穩，即AMB濃度在0～2 μg/ml范圍內，峰強比與AMB濃度呈負相關，而且當藥物濃度為0.5 μg/ml時即可接近于高濃度的藥物作用時所表現出來的峰強比，低于AMB對白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC80)1 μg/ml，這在藥物量的使用上要優于傳統的方法。從藥物的作用時間上分析，AMB與白色念珠菌作用5 min即可與作用60、120、240 min所測的譜圖效果一致，因此，AMB對白色念珠菌的抑制作用可以在其相互作用只有5 min的時間內，用所檢測的拉曼位移656 cm-1與729 cm-1處的峰強比來進行表征，與傳統的方法相比，大大節省了實驗時間。

圖1 75 nm納米銀球的紫外吸收譜(A)和掃描電鏡圖(B)

2.4 MCF與白色念珠菌作用的光譜圖

同時，筆者考察了同樣是殺菌劑的棘白菌素類抗生素米卡芬凈鈉(MCF)對白色念珠菌的抑制作用，將MCF用去離子水溶解，配成藥物濃度為0、0.0312 5、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μg/ml的菌液，其他條件和分析方法與上述一致，結果見圖4和圖5。

結果表明，MCF與白色念珠菌作用的時間為5 min、60 min和120 min時，峰強比與MCF的濃度并沒有明顯的相關性，作用時間為120 min時，只有高濃度的MCF下才會表現出MCF的濃度與峰強比趨于負相關；當作用時間高達240 min時，MCF的濃度與峰強比趨于負相關，且只在較高濃度2、4 μg/ml時峰值才趨于平穩，遠遠高于MCF對白色念珠菌的MIC80(0.25 μg/ml)。

圖2 AMB與白色念珠菌不同相互作用時間的拉曼光譜圖 A.孵育5 min；B.孵育60 min；C.孵育120 min；D.孵育240 min(AMB的濃度由a至i依次為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/ml)

圖3 不同作用時間對峰比值與AMB濃度的關系 A.5 min;B.60 min；C.120 min;D.240 min

圖4 MCF與白色念珠菌不同相互作用時間的拉曼光譜圖 A.5 min;B.60 min；C.120 min;D.240 min(MCF的濃度由a至i依次為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0 μg/ml)

3 討論

液體在硅片表面從濕到干變化的過程中，由于毛細現象，粒子的間距逐漸變小，團聚增加的同時“熱點”也會相應地增多，因此待測分析物的SERS信號大大增強(主要增強為電磁增強)。白色念珠菌656 cm-1和729 cm-1的特征峰歸屬于嘌呤代謝物[19-21]，因而產生較大拉曼散射截面的嘌呤代謝物能夠顯示在SERS光譜中。

當不同濃度AMB與白色念珠菌相互作用后，AMB濃度在0～2 μg/ml范圍內，拉曼位移656 cm-1與729 cm-1處的峰強比與AMB濃度成負相關，當AMB濃度在低于其最小抑菌濃度0.5 μg/ml時即可接近于高濃度的藥物作用時所表現出來的峰強比，且AMB與白色念珠菌作用時間僅為5 min時即可達到上述的規律及優點，因此，AMB對白色念珠菌的抑制作用可以在其相互作用只有5 min的時間內，用所檢測的拉曼位移656 cm-1與729 cm-1處的峰強比來進行表征。

關于2種殺菌藥物測定結果的差異，我們的解釋如下：由于MCF類藥物的作用機制是在細胞中非競爭性抑制白色念珠菌細胞壁的重要組成成分β-1,3-葡聚糖合成，破壞細胞壁結構的完整性導致細胞死亡，因此其原因是可能由于此類藥物進入細胞后非競爭性抑制β-1,3-葡聚糖合成酶的作用，而不像AMB一樣造成膜孔致使細胞內容物外流，其造成的損害過程較為緩慢的，但因此類藥物抑制了細胞壁的合成，隨著時間增長，藥物濃度升高，細胞壁的破壞較為嚴重，影響細胞膜的通透性，導致細胞內容物外流，具有較大散射截面的嘌呤代謝物才能夠被檢測到，在光譜圖中顯示出來。

4 結論

本研究表明D-SERS法可用于描述AMB對白色念珠菌的殺菌作用，為表征AMB對白色念珠菌的抑制作用提供了一種更簡單、快速的檢測方法。

同時，隨著科技的發展，方法的穩定性得以提高后，還可進一步應用于其他藥物與菌株，其快速檢測能為臨床病原菌的早期診斷提供基礎。