呼倫貝爾地區寵物犬子宮內膜炎致病菌的分離鑒定與耐藥性分析

王顯峰 , 白薩日娜

(扎蘭屯職業學院 ， 內蒙古 扎蘭屯 162650)

研究表明，寵物犬相關疾病逐漸增多，如犬瘟熱、細小病毒、寄生蟲蟲病、腹瀉、子宮內膜炎等[1]。因此，在寵物犬養殖過程中，應該注意相關疾病的預防，定期檢測、免疫，同時還要注意環境衛生與消毒。臨床中母犬生殖系統疾病逐漸增多，尤其是子宮內膜炎發生頻率逐漸增多，成為母犬生殖系統疾病中重要疾病之一，寵物犬的子宮內膜炎大多數由于產后護理不當或者外界細菌感染后引起的子宮內膜炎癥病變，寵物犬子宮感染細菌后可以引起子宮的嚴重損傷，同時可以繼發其他的器官感染[2-3]。臨床中許多病原菌均可以引起動物子宮內膜炎，嚴重者可以引起死胎、流產[4]。臨床中關于奶牛子宮內膜炎的病原菌的報道較多，致寵物犬子宮內膜炎病原菌報道的較少。本試驗從寵物醫院采集患子宮內膜炎犬的內容物、陰道分泌物等病料組織240份，進行病原菌分離鑒定、致病性檢測及耐藥性分析，為寵物犬子宮內膜炎治療用藥提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 采集呼倫貝爾地區寵物醫院患子宮內膜炎寵物犬的內容物、陰道分泌物等病料組織240份。

1.2 試劑與儀器 增菌培養基、哥倫比亞培養基、7%綿羊血培養基、大腸桿菌顯色鑒別培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，均購自成都康迪生物科技有限公司；大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌生化鑒定試劑盒、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭陰性、陽性菌基因組 DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；梯度PCR儀、離心機、隔水式恒溫培養箱等儀器由本實驗室提供。

1.3 實驗動物 體重(25±2.2)g健康昆明系雌性小鼠290只，購自呼倫貝爾市實驗動物中心。

1.4 分離與鑒定 將采集的患子宮內膜炎寵物犬的子宮內容物、陰道分泌物等病料組織進行處理，接種到增菌液中，37 ℃震蕩培養12-18 h，取擴增菌液中病原菌分別接種于哥倫比亞培養基、7%綿羊血培養基、大腸桿菌顯色鑒別培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基進行鑒別培養，挑取鑒別培養基上單個菌落接種于營養肉湯中進行純化培養，取純化培養的分離菌株進行染色鏡檢和生化試驗。

1.5 細菌生化試驗 按照說明書，調整純化培養的分離菌株菌液濃度，分別接種于大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌生化鑒定試紙條中培養，用自動細菌生化鑒定系統鑒定。

1.6 細菌的PCR鑒定 參考文獻[5-6]，設計大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌保守區基因序列特異引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用革蘭陰性、陽性菌基因組 DNA 提取試劑盒提取分離株的基因組DNA，用特異性引物進行PCR鑒定，其PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與GenBank數據庫中登錄參考株的基因序列進行同源性比對。

1.7 細菌致病性試驗 參考文獻[5]，調整分離菌株的菌液濃度為1.0×108CFU/mL，將290只小鼠隨機分為145組，每組2只，試驗組為1～144組，每株菌株為1個試驗組，陰道注射2只小鼠，劑量為0.25 mL，145組為對照組，給予等量的無菌PBS，攻毒后觀察6 d，記錄發病死亡情況并進行細菌鑒定。

表1 引物序列

1.8 藥敏試驗 參照用美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)2018年推薦的標準K-B紙片法進行，按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷，分析耐藥性。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定 疑似大腸桿菌的分離菌株在大腸桿菌顯色鑒別培養基長出圓形的、邊緣整齊的綠色的菌落，鏡檢呈兩端鈍圓桿狀陰性菌；疑似鏈球菌分離菌株在7%綿羊血培養基、哥倫比亞培養基上長出了圓形的、大小一致的、略帶黏液樣菌落呈現β溶血，鏡檢呈單個散在或多個球形陽性菌；疑似金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上長出圓形的、邊緣整齊的淺黃色菌落，在7%綿羊血培養基呈現β溶血，鏡檢呈單個短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽性球菌。

2.2 細菌生化鑒定結果 55株菌株的V-P試驗呈陰性、吲哚和甲基紅反應為陽性，能分解甘露醇、葡萄糖、麥芽糖產酸產氣，被鑒定為大腸桿菌； 48株菌株的靛基質試驗陰性、V-P試驗和過氧化氫酶試驗陽性，分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，且產酸不產氣，被鑒定為金黃黃色葡萄球菌；40株菌株的V-P試驗為陽性，發酵乳糖、七葉苷、水楊酸、山梨醇；不發酵核糖、甘露醇、菊糖及棉籽糖，被鑒定為鏈球菌。

2.3 細菌PCR鑒定 PCR鑒定結果顯示，55株分離株擴增出大腸桿菌目的基因片段231 bp，48株分離菌株擴增出金黃黃色葡萄球菌目的基因片段418 bp，40株分離菌株擴增出鏈球菌目的基因片段874 bp。測序結果：3種病原菌的測序結果與GenBank庫中登錄的分離的大腸桿菌、金黃黃色葡萄球、鏈球菌參考株基因序列同源性97.9%～99.9%之間。從而證明了從采集的病料組織240份中分離得到了56株大腸桿菌、48株致病性試驗結果金黃色葡萄球菌、40株鏈球菌。

2.4 致病性試驗結果 試驗組小鼠在攻毒后的3-4 d出現精神沉郁、采食量減少、外陰部出現腫脹、流出膿性黏液，個別小鼠出現死亡。從發病死亡的的小鼠體內分離到大腸桿菌、金黃黃色葡萄球菌、鏈球菌。對照組小鼠無明顯的癥狀。根據試驗結果統計，42株大腸桿菌、32株金黃色葡萄球菌、30株鏈球菌對小鼠具有致病性。

2.5 耐藥性分析結果 試驗結果見表2， 42株致病性大腸桿菌對強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、環丙沙星、氟苯尼考、大觀霉素、青霉素G、阿莫西林、氨芐西林9種藥物的耐藥率在45.2%～100%之間，對林可霉素、恩諾沙星、頭孢噻呋、頭孢曲松4種藥物的耐藥率在11.9%～28.6%之間；32株致病性金黃色葡萄球菌對氟苯尼考、大觀霉素、強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、環丙沙星、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林9種藥物的耐藥率在42.9%～100%之間；林可霉素、恩諾沙星、頭孢噻呋、頭孢曲松耐藥率在12.5%～25.0%；30株致病性鏈球菌對青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、環丙沙星、氟苯尼考、大觀霉素、強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶9種藥物耐藥率在40.0%～96.7%之間，對頭孢噻呋、頭孢曲松、恩諾沙星、林可霉素4種藥物耐藥率在13.3%～33.3%之間。

表2 耐藥性分析結果

3 討論

臨床中許多病原菌均可以引起動物子宮內膜炎，嚴重者可以引死胎、流產，引起寵物犬子宮內膜炎的病原菌主要包含大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等[6-7]。本試驗從呼倫貝爾地區寵物醫院采集患子宮內膜炎寵物犬的子宮內容物、陰道分泌物等病料組織240份，通過采用細菌學鑒定和PCR法分離得到了56株大腸桿菌、48株金黃色葡萄球菌、40株鏈球菌，通過人工感染動物試驗對分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌驗證其致病性，結果顯示，42株大腸桿菌、32株金黃色葡萄球菌、30株鏈球菌對小鼠具有致病性，說明致寵物犬子宮內膜炎病原菌以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌為主。劉明達等[3]報道了從石河子市部分寵物醫院采集的48例患病犬的陰道分泌物和子宮內容物中分離出58株致病菌，其中主要包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌等。與本試驗結果存在差異性可能與地區有關。國內關于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌引起奶牛子宮內膜炎報道較多，關于寵物犬報道較少。因此，本試驗對分離的致寵物犬子宮內膜炎大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌進行耐藥性分析。

在小動物臨床治療中為了控制細菌性感染，抗菌藥物不合理使用，很容易導致很強的耐藥性，由于寵物犬與人接觸，其攜帶的耐藥菌有可能通過親密接觸在人類中傳播[8-9]。本試驗藥敏試驗結果表明，42株大腸桿菌對強力霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶等9種藥物的耐藥率在45.2%～100%之間，32株金黃色葡萄球菌對氟苯尼考、大觀霉素、強力霉素等9種藥物的耐藥率在42.9%～100%之間，30株致病性鏈球菌對青霉素G、阿莫西林、氨芐西林等9種藥物耐藥率在40.0%～96.7%之間。說明在臨床中對寵物犬的子宮內膜炎的治療時，不合理的使用抗菌藥物，造成寵物犬源致病菌產生很強的耐藥性。因此，在臨床治療相關疾病應該引起重視。