青海大通北川河源區魚類舌狀絳蟲和雙線絳蟲的分子鑒定及系統發育關系研究

伊平昌 ， 李國平 ， 顧冬花 ， 趙志剛 ， 張成圖 ， 盧福山

(1.青海省大通縣畜牧獸醫站 ， 青海 西寧 810199 ； 2.青海省西寧市畜牧獸醫站 ，青海 西寧 810005 ； 3.青海大學農牧學院 ， 青海 西寧 810016)

青海大通北川河源區國家級自然保護區位于青海省西寧市大通縣境內，湟水河一級支流-北川河源頭，海拔2 680～4 622 m，保護區涉及寶庫、青林、青山、向化、樺林共5個鄉鎮，總面積約10.79萬公頃，占大通縣總面積的34.91%[1-2]。青海大通北川河源區國家級自然保護區特殊的植被和復雜的地理環境，為這里的魚種提供了豐富的食物來源，使魚類資源順利繁衍生息。本試驗通過對青海大通北川河源區內魚類寄生的絳蟲進行了分子生物學鑒定，確定為舌狀絳蟲和雙線絳蟲，進一步豐富了魚類動物的生物多樣性，為魚類資源保護和絳蟲病防治提供了理論依據和防治資料。

1 材料與方法

1.1 蟲體采集 本試驗于2016年8月至2017年7月，分別按季節在青海大通北川河源區主要河流段(北緯N37°17′，東經E101°09′)將捕獲的367尾魚類樣本進行解剖，用挑蟲針鉤取扁平長帶狀、不分節、乳白色“面條樣”蟲體(見中插彩版圖1)，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈后，置于70%酒精甘油中保存，備用。

圖1 “面條樣”蟲體標本
a ： 舌狀絳蟲 ； b ： 雙線絳蟲

1.2 引物 所用引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，見表1。

表1 PCR分子生物學鑒定所用引物

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 剪取各0.5 cm3大小形態的蟲體組織塊分別放入新的保存管中，用剪刀剪碎組織，利用天根生化科技(北京)有限公司生產的DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作步驟按照試劑盒使用說明書進行，DNA置于-20 ℃長期保存。

1.3.2 PCR鑒定 兩種蟲體的CoxI、ItsI和NadI基因引物參考Zehnder等[3]基因的引物和基于在NCBI上下載絳蟲的序列，經Genedoc軟件比對后，利用Primer3 Input (Version 0.4.0)軟件進行引物設計。為保險起見，將目的片段分兩個部分上下引物擴增后，進行PCR分子生物學鑒定。PCR擴增酶為天根生化科技(北京)有限公司的蛋白酶K，擴增反應體系如下：Mastrer Mix 25.0 μL，上、下游引物(濃度10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 7 μL，重蒸餾水19 μL至PCR反應體系為50 μL(均購自天根生化科技(北京)有限公司)。為了避免試劑是否存在污染，每組PCR均設立不含模板的空白對照來檢測。擴增后PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳(電壓120 V，時間30 min)，電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結果并拍照。目的條帶的膠塊采用DNA膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司產品)進行膠回收。

1.3.3 序列分析 陽性產物測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，采用Sanger雙脫氧鏈終止法進行雙向測序。測序結果經峰圖分析后，在GenBank上用采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法進行同源序列搜索，應用MEGA 5.10軟件和Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件進行分析核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。

1.3.4 構建系統發育樹 通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務軟件下載其他舌狀絳蟲和雙線絳蟲的CoxI、ItsI和NadI核苷酸基因序列。利用MEGA 5.10軟件的系統發育樹構建功能對這些基因序列進行分析，選擇鄰近法(Neighbor-Joining method，NJ)構建系統發育樹，并使用自展值(Bootstrap)檢驗其可靠性，重復次數為2 000，分析不同分離株絳蟲間的進化關系。

2 結果

2.1 PCR分子鑒定 利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，基于CoxI基因進行PCR擴增，擴增出約480 bp的目的片段；基于ItsI基因進行PCR擴增鑒定，擴增出1 500 bp的目的片段；同樣基于NadI基因進行PCR擴增鑒定，擴增出500 bp的目的片段；分別得到了3條目的基因片段(與預期的目的條帶長度相符)，目的條帶的膠塊進行膠回收、測序。所得序列在GenBank用BLAST進行同源序列搜索，結果表明,兩種樣品經分子鑒定為舌關絳蟲(Ligulaintestinalis)和雙線絳蟲(Digrammainterupta)。

2.2 基因同源性對比分析 用Clustal Omega在線軟件的Clustal 2.1方法，將2種蟲體克隆序列(CoxI、ItsI和NadI基因序列)進行研究鑒定，與已上傳到GenBank上的舌狀絳蟲(Ligulaintestinalis)和雙線絳蟲(Digrammainterupta)核苷酸序列分別進行同源性比較，見表2、表3。結果表明，舌狀絳蟲的CoxI基因序列與EU241312 (法國)和EU241317(法國)的核苷酸序列同源性分別為97.8%和97.3%，ItsI基因序列與KC900973 (伊朗)和KC900974(伊朗)的核苷酸序列同源性分別為95.1%和99.3%，NadI基因序列與AF524046 (中國)、AF524043 (中國)、AF524044 (中國)和AF524045 (中國)的核苷酸序列同源性分別為84.2%、83.4%、69.9%和69.6%；雙線絳蟲的CoxI基因序列與EU241317 (法國)、EU241287(法國)、 EU241309 (法國)和EU241281(法國)的核苷酸序列同源性分別為78.3%、78.6%、79.6%和78.6%，ItsI基因序列與KC900973 (伊朗)和KC900974 (伊朗)的核苷酸序列同源性分別為96.0%和98.9%，NadI基因序列與AF524045 (中國)、AF524043 (中國)、AF524044 (中國)和AF524023 (中國)的核苷酸序列同源性分別為84.6%、67.0%、67.6%和99.5%。這兩種蟲體在GenBan中進行同源性比較分析發現，不同線粒體基因標記顯示出的物種差異性較大，且沒有1條DNA序列與它們有100%的同源性。本研究鑒定的分離株Ligulaintestinalis和Digrammainterupta與伊朗(KC900974)分離株及中國分離株(AF524023)序列同源性較高，并被發現鑒定。

表2 舌狀絳蟲3種不同基因與其參考序列的核苷酸序列的同源性比較

表3 雙線絳蟲3種不同基因與其參考序列的核苷酸序列的同源性比較

2.3 系統發育進化分析 選取GenBank已發表的相應序列運用MEGA 5.10中的鄰近法(Neighbor-Joining method，NJ)構建兩種蟲體包含分離株的3種基因(CoxI、ItsI和NadI基因)的相應進化樹(圖2～7)。結果表明，本研究鑒定的舌狀絳蟲分離株與伊朗分離株種屬親緣關系較近，與其他絳蟲所屬分支相隔較遠，與李偉平等[4]研究的結果相一致；雙線絳蟲分離株與我國分離株種屬親緣關系較近，在進化上與其他地區的分離株遺傳進化距離較遠。從進化樹的分支狀況發現，舌狀絳蟲和雙線絳蟲雖然存在分支跨越，但均聚在一個大的分支上，與其他屬種明顯分開。

2.3.1 舌狀絳蟲進化分析

2.3.1.1 基于舌狀絳蟲CoxI基因對不同種類絳蟲遺傳距離及系統進化樹見圖2。根據其系統發育樹判斷與法國同屬一支，和中國本土遺傳體系較為接近。

2.3.1.2 基于舌狀絳蟲ItsI基因對不同種類絳蟲遺傳距離及系統進化樹見圖3。根據系統發育樹可判斷其遺傳體系為獨立的一支。

2.3.1.3 基于舌狀絳蟲NadI基因對不同種類絳蟲遺傳距離及系統進化樹見圖4。根據系統發育樹判斷其與中國本土遺傳體系同屬一支，與日本、韓國遺傳體系較為接近。

圖2 基于CoxI基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)

圖3 基于ItsI基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)

圖4 基于NadI基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)

2.3.2 雙線絳蟲進化分析

2.3.2.1 基于雙線絳蟲CoxI基因對不同種類絳蟲遺傳距離及系統進化樹見圖5?？膳袛喑雠c法國同屬一支，遺傳體系較為接近。

圖5 基于CoxI基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)

2.3.2.2 基于雙線絳蟲ItsI基因對不同種類絳蟲遺傳距離及系統進化樹見圖6?？膳袛喑鲭p線絳蟲ItsI基因為獨立的一支遺傳體系。

圖6 基于ItsI基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹 (NJ樹)

2.3.2.3 基于雙線絳蟲NadI基因對不同種類絳蟲遺傳距離及系統進化樹見圖7?？膳袛喑雠c中國本土的遺傳體同屬一支，絳蟲屬遺傳體系較為接近。

3 討論

本研究利用3個線粒體CoxI、ItsI和NadI基因進行了舌狀絳蟲和雙線絳蟲的分子鑒定。線粒體基因是區別不同地域絳蟲及其幼蟲的標識基因，應運最廣的為CoxI基因與NadI基因[5]，本試驗通過對青海大通北川河源區魚類絳蟲種屬內對比鑒定分析，發現舌狀絳蟲的差異性為6%～8%，雙線絳蟲為8%～10%，兩者皆可作為遺傳研究的標記。兩種蟲體序列間分析發現CoxI基因變異程度高于NadI基因，其中舌狀絳蟲CoxI基因片段中45個變異位點上存在堿基的倒置、轉換和缺失，而在雙線絳蟲的33個變異位點上堿基均缺失。兩種蟲體種屬內對比，發現CoxI基因的差異性達到11%以上，在NCBI-Blast中檢索得到的其他絳蟲作比對，差異性達6%～8%，與大通地區的地理位置和蟲體寄生有關。在ItsI基因種屬內對比發現差異性較其他兩個基因片段較小，能有效地識別亞種內的物種，在NCBI-Blast中檢索得到的其他絳蟲比對，發現其同源性很高，而差異性小，在系統發育樹上兩種蟲體的ItsI基因均作為獨立的一支。從進化樹的分支狀況可以發現，舌狀絳蟲和雙線絳蟲雖然存在分支跨越，但是均聚在一個大的分支上，與其他屬種明顯分開。這些結果表明，CoxI和ItsI基因均可用于舌狀絳蟲和雙線絳蟲種的系統發育研究。

圖7 基于 NadI 基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹 (NJ樹)

利用以基因為分子標記進行鑒定研究，豐富了寄生蟲的鑒定方法，促進了寄生蟲分類的發展[4]。相對于核基因組來說，線粒體基因組具有分子量小、結構簡單、基因排列緊密、嚴格母系遺傳、進化速率較快和無組織特異性等特點，特別適合作為遺傳學研究的標記[6]。通過 DNA 序列、蛋白質序列、蛋白質結構等構建系統發育進化樹，用類似樹狀分支的圖來表示各種(類)生物之間的親緣關系，通過對生物序列的研究來推測物種的進化歷史。

本試驗對我國青海大通北川河源區國家級自然保護區河流中魚類體內感染的舌狀絳蟲(Ligulaintestinalis)和雙線絳蟲(Digrammainterupta)的CoxI、NadI和ItsI基因序列進行克隆測序并進行了分子鑒定；同時，運用CoxI、NadI和ItsI3種基因進行了屬種之間的分子系統發育初步探究，比較了主要蟲種間基因的序列同源性，得到了系統發育樹，初步闡明了鑒定種與其他種屬之間的系統發育關系。