仔豬腹瀉大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析

劉麗娟 ， 馬光強 ， 王 偉 ， 王開功 ， 周碧君

(1.貴州省都勻市農業農村局 ， 貴州 都勻 558000 ；2.黔南民族職業技術學院 ， 貴州 都勻 558000 ； 3.貴州大學動物科學學院 ， 貴州 貴陽 550025)

仔豬腹瀉是全球養豬業面臨的豬群常發疾病之一，具有高發病率、高死亡率等特點，嚴重影響了養豬業的發展[1]。引發仔豬腹瀉的病原有很多，包括大腸埃希菌、魏氏梭菌、豬痢疾密螺旋體、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬球蟲、豬蛔蟲等[2]。其中大腸埃希菌一直被認為是引發仔豬腹瀉的重要病原之一，可引發仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病[3]。由于大腸埃希菌血清型眾多，各地區的流行菌株不一，導致疫苗預防效果并不理想，養殖戶為降低腹瀉發病率，常在生產活動中大量添加抗生素[4]。為此大腸埃希菌耐藥菌株不斷增多，耐藥機制也日趨復雜，致使細菌耐藥性問題日趨嚴重，防治難度越來越大。如何有效防治豬大腸埃希菌病成為規模化養豬場亟需解決的難題。為了解貴州地區仔豬腹瀉大腸埃希菌病流行情況和耐藥的情況，本試驗對2016年4月-7月間采集于貴州地區規模化養豬場的128份腹瀉仔豬腸道樣本進行了細菌的分離鑒定、致病力試驗及耐藥性分析，旨在為豬大腸埃希菌病的防控提供參考理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2016年4-7月間采集貴州省4個地(州、市)7個規模化養殖場出現腹瀉癥狀的仔豬腸內容物128份，4 ℃保存送至貴州大學動物疫病研究室立即做細菌分離培養。

1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂、營養肉湯培養基、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL-2 000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產分析純。大腸埃希菌質控菌株ATCC25922由貴州省動物疫病研究室保存。

1.3 引物 根據大腸埃希菌的保守基因序列特征，參考馬光強[5]2016年報道的大腸埃希菌特異性鑒定引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 通用鑒定基因PCR引物序列

1.4 實驗動物 BALB/c小鼠，購自貴州醫科大學實驗動物中心。

1.5 細菌分離培養及生化鑒定 取腹瀉仔豬腸道樣品接種于營養肉湯培養基，37 ℃過夜培養，將增菌液用接種環在麥康凱瓊脂培養基上進行“Z”字型劃線，37 ℃培養18-24 h 后，挑取單個菌落進行純培養，觀察菌落形態、革蘭染色鏡檢，并用腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管對純培養物進行生化鑒定。

1.6 PCR鑒定 以細菌基因組DNA提取試劑盒所提取分離菌基因組總DNA為模板，應用表1中引物進行目的基因擴增。PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL、基因組DNA模板1.0 μL、上下游引物各1.0 μL(10 μL mol/L)、加滅菌雙蒸水補足至20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s；72 ℃ 延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 動物致病性試驗 將鑒定的大腸埃希菌菌液按0.2 mL/只(5.9×108CFU/mL)劑量，腹腔注射小鼠，空白對照組小鼠，腹腔注射0.2 mL滅菌生理鹽水。觀察并剖檢發病和死亡的小鼠，統計致死率，組織采樣后回接至麥康凱瓊脂，取優勢細菌染色觀察并與初始培養細菌對比。

1.8 藥物敏感性試驗 按照細菌藥敏試紙使用說明書及美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2012年制定的藥敏紙片瓊脂擴散法標準(K-B 法)進行，將分離菌接種在 LB 液體培養基中增菌培養，分別均勻涂布于普通營養瓊脂培養基，選取4大類抗生素共 12 種常見藥敏紙片貼于培養基上，置 37 ℃培養 24 h，測量抑菌圈直徑，按該標準進行結果判定。以大腸埃希菌 ATCC 25922 作為質控菌株。

2 結果

2.1 細菌分離培養及生化鑒定 128份樣本有78份在麥康凱培養基上均長出邊緣光滑整齊、濕潤、粉紅色扁圓形小菌落(中插彩版圖1)；挑取典型菌落進行革蘭染色、鏡檢，可見菌體為兩端鈍圓、紅色、散在或者成雙排列的革蘭陰性桿菌(中插彩版圖2)。生化鑒定結果顯示，78株分離菌靛基質、甲基紅、葡萄糖(產氣) 、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、木糖試驗均呈陽性; 硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素、側金盞花醇、氨基酸對照試驗均呈陰性; 半固體瓊脂動力試驗中僅有11株菌運動性呈陰性，其他均呈陽性。根據腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管第二代15e系列檢索表，按照鑒定值查找編碼結果顯示，78株分離菌均為大腸埃希菌，分離率為61%(78/128)。

圖1 分離菌在血平板上的生長情況

圖2 分離菌革蘭染色顯微鏡下觀察結果(×1 000)

2.2 大腸埃希菌分子生物學方法鑒定 將用傳統方法分離鑒定的78株大腸埃希菌按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，并以此為模板進行大腸埃希菌23S rRNA基因的PCR擴增，產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。結果顯示，78株大腸埃希菌均擴增出條帶單一明亮的特異性條帶。

通過生化和PCR鑒定方法分離鑒定到的大腸埃希菌進行符合率統計分析，結果顯示，PCR鑒定方法與傳統生化鑒定的結果一致，符合率達 100%(78/78)。

圖3 大腸埃希菌PCR擴增結果
M：DL-2 000 DNA Marker ; 1:陽性對照 ；2～5：分離菌株 ； N：陰性對照

2.3 大腸埃希菌致病性試驗 將分離鑒定的78株大腸埃希菌進行動物致病性試驗，結果顯示，試驗組BALB/c小鼠注射菌液后均出現昏睡、厭食、被毛蓬亂、反應遲鈍、精神萎靡等癥狀，少數可見拉稀癥狀；剖檢可見腹腔充滿黏性黃色滲出物，肝臟和腎脾腫大，腸道膨脹充氣等病變。78株大腸埃希菌分離株中有56株均在48-72 h內致小鼠死亡，致死率71.79%(56/78)，而對照組小鼠無發病死亡。從死亡小鼠的肝臟和腹腔滲出液分離到培養特性、菌落形態均相同的分離菌，經PCR鑒定為大腸埃希氏菌。

2.4 致病性大腸埃希菌耐藥表型分析 對分離鑒定的大腸埃希菌進行藥敏試驗，結果如表2所示，分離鑒定的78株大腸埃希菌對β-內酰胺類藥物青霉素耐藥率最高，為94.87%(74/78)，對磺胺類藥物復方新諾明耐藥率最低，為21.79%(17/78)，對其余抗菌藥物均表現出不同程度的廣泛耐藥。

表2 78株致病大腸埃希菌分離株對12種抗菌藥物敏感性試驗

2.5 大腸埃希菌多重耐藥性分析結果 本試驗受試抗菌藥物屬于4類，3種為磺胺類，3種為氟喹諾酮類，3種β酰胺類，3種氨基糖苷類，多重耐藥結果可知，78株大腸埃希菌分離株均為多重耐藥菌株，其中2株耐3種藥，耐藥率為2.6%(2/78)；5株耐4種藥，耐藥率為6.4%(5/78)；4株耐5種藥，耐藥率為5.1%(4/78)；2株耐6種藥，耐藥率為2.6%(2/78)；11株耐7種藥，耐藥率為14.1%(11/78)；15株耐8種藥，耐藥率為19.2%(15/78)；17株耐9種藥，耐藥率為21.7%(17/78)；8株耐10種藥，耐藥率為10.2%(8/78)；14株耐11種藥，耐藥率為17.9%(14/78)。 所有分離菌株均為多重耐藥菌株，多重耐藥主要表現在7～11耐，占分離菌株的83.33%(65/78)。

3 討論

近年來，隨著我國養豬業的規模化發展，仔豬腹瀉的發生與流行有明顯增加的趨勢。豬腹瀉對養豬業危害巨大，仔豬最為嚴重。大腸埃希菌作為條件性致病菌，當外界環境改變、應激、飼料霉變等均易誘發本病[6]。大腸埃希菌引起的仔豬腹瀉因發病日齡不同臨床癥狀不同，仔豬黃痢主要發生在 1-3日齡內新生仔豬，仔豬白痢主要發生在10-30日齡哺乳仔豬，豬水腫病引起的腹瀉主要發生在斷奶后仔豬[7]。通常情況下，大腸埃希菌病的發病率和死亡率均較高，也是一類重要的人獸共患病。因此，對豬大腸埃希菌病應采取及時有效的防治措施。

本試驗從貴州省4個地(州、市)7個規模化養殖場出現腹瀉癥狀的128份仔豬腸內容物中共分離到78株豬源大腸埃希菌，分離率為60.94(78/128)；這一結果低于馬長賓等(2016)[8]從新疆7個規模養豬場361份豬腹瀉腸道樣本中共分離到335株豬大腸埃希菌的分離率92.80%(335/361)，以及劉哲等(2017)[9]從河南省1個規模化養殖場1～7日齡腹瀉仔豬69份肛拭子樣品中共分離到69株豬大腸埃希菌的分離率100%(69/69)；高于李金鵬等(2018)[10]從河南省15家豬場腹瀉病豬152份腸內容物中共分離到79豬豬源大腸埃希菌的分離率為51.97%(79/152)。這些差異可能是由于地域差異、動物健康程度不同或不同養豬場的用藥情況不同所致。

近年來，用于防治仔豬大腸埃希菌病的藥物常為抗生素，在應用抗生素的過程中不僅會殺滅病原菌，還會使得正常菌群失調，從而降低動物機體的抵抗力，且長期不合理使用更易產生耐藥性[11]。本試驗分離的78株大腸埃希菌對青霉素、氨芐西林、哌拉西林、慶大霉素、卡那霉素的耐藥率較高，耐藥率均超過80%；對其他試驗抗生素的耐藥率均在20%～80%之間。這與劉哲等(2017)[9]、楊宇(2017)[12]和吳學敏等(2017)[13]的報道基本一致，但與谷振等(2018)[14]、趙曉黎(2017)[15]和艾偉昌等(2017)[16]的報道存在明顯差異。這種差異可能是因地域不同、動物種類不同、動物健康程度不同或不同養殖場的用藥情況不同所致。從多重耐藥情況來看，貴州省仔豬腹瀉致病性大腸埃希菌多重耐藥情況嚴重，3耐及3耐以上菌株高達100%，這一結果均高于艾偉昌等(2017)[16]、寧昆等(2016)[17]及蒲承君等(2017)[18]的研究。表明大腸埃希菌多重耐藥受多種因素的影響。

仔豬腹瀉病因復雜，往往是由多種因素共同作用的結果，如許多病毒性疫病、其他細菌性疫病、某些寄生蟲病等[19]。雖然本次試驗結果不足以說明分離獲得的大腸埃希菌是引發仔豬腹瀉的唯一因素，但根據藥物敏感性試驗結果調整臨床用藥，腹瀉仔豬癥狀得到了緩解和控制。因此建議豬場避免使用或添加同類抗生素，定期對本地分離株進行藥敏試驗篩選出敏感藥物，采取聯合用藥、交叉用藥和輪換用藥等方式，可減少耐藥性的產生。