β-防御素與奶牛乳腺炎的研究進展

蘇布登格日勒 ， 溫婧怡 ，張 曼 ， 金 鑫 ， 王云鶴 ， 魏 方 ， 楊銀鳳

(內蒙古農業大學獸醫學院 ， 內蒙古 呼和浩特 010018)

據報道，全球每年僅因奶牛乳腺炎造成的經濟損失就高達350億美元，我國每年因奶牛乳腺炎造成的經濟損失也達15億人民幣[1]。奶牛乳腺炎是由革蘭陰性菌和陽性菌以及真菌引起的在奶牛中最常見也是最有經濟破壞力的疾病，對產奶質量和數量都有較大影響[2]。而在獸醫治療過程中使用抗生素和牲畜淘汰仍為治療奶牛乳腺炎的主要手段。但也由于乳腺炎治療過程中抗生素的大量使用對牛奶質量造成了顯著影響，如乳制品中抗生素殘留，會對飲用這類問題牛奶的人造成生理傷害，從而造成更大范圍內的經濟損失。到目前為止，盡管奶牛乳腺炎已經得到了較為有效的控制，但它仍是現階段全球乳業所面臨的主要挑戰之一。

乳腺炎致病因素非常多，主要原因還是與環境和生物體自身遺傳免疫有關[3]。幾個世紀以來物種之間易感性的暴露，使得包括天然免疫在內的第一道免疫防線經過不斷篩選變得更加適合自然環境生存。而防御素就是生物在長期不斷進化中保留的天然免疫中重要組成成分之一。防御素廣泛分布于植物以及脊椎動物和無脊椎動物，根據其二硫鍵和半胱氨酸位置分為α、β和θ-防御素[4]。

作為防御素家族主要成員的β-防御素，是一種富含半胱氨酸的陽離子抗微生物肽[5]。有研究表明，這種半胱氨酸可以保護肽不被消化[6]。近年來發現哺乳動物β-防御素的免疫調節作用可以調節炎癥和激活免疫系統。目前在牛體內只發現了β-防御素[7]。而β-防御素也恰恰是牛發生乳腺炎感染之后除了天然性物理免疫屏障之外，最易產生有效防御的物質。

1 牛β-防御素

1.1 牛β-防御素研究發現過程 牛β-防御素包括舌抗微生物肽(Lingual antimicrobial peptide，LAP)，牛嗜中性粒細胞β-防御素(Bovine neutrophil β-defensins，BNBD)，氣管抗微生物肽(Tracheal antimicrobial peptide，TAP)以及腸道β-防御素(Enteric β-defensin，EBD)[8]。第一種牛防御素是由Diamond等人從牛呼吸道中分離出來，并被命名為TAP[9]。Selsted在1993年報道發現了13個牛β-防御素序列[10]。2004年， Roosen等人報道了18個牛防御素基因，其中還包括6個新發現的β-防御素基因(DEFB401、DEFB402、DEFB403、DEFB404、DEFB405和LAP like)[11]。隨后研究者對牛的各種β-防御素進行了聚類分析，結合人、黑猩猩、老鼠、大鼠和狗上已公布的防御素特征性數據，在牛的第8、13、23、27號染色體上共鑒定出58個基因，分別命名為A簇、B簇、C簇和D簇。其中A簇基因最少，D簇有重要的免疫基因，B簇和C簇的防御素基因在生殖道中表達[12]。研究表明，位于27號染色體上的基因可以抵抗乳腺炎。綜合對人、狗、黑猩猩、大鼠和小鼠的線性分析，發現27號染色體D簇上有30個基因，其中11個特定屬于牛，包括TAP、LAP、EAP、DEFB4A、DEFB5、BNBD7、BNBD10、BNBD10A、BNBD11、BBD403和BBD1[13]。本文聚焦于在乳腺和乳體細胞中表達的可以作為乳腺炎抵抗力標記的β-防御素。

1.2 與牛乳腺炎有關的β-防御素研究發現過程

1.2.1 LAP LAP首先在炎性鱗狀上皮細胞中分離獲得[14]。然而除了舌上皮細胞，被感染的腸、呼吸道組織和乳腺上皮細胞中也發現有LAP表達。在母牛乳腺中就報道了有關LAP mRNA的表達，文章描述了乳汁中體細胞計數(Somatic cell count， SCC)與LAP mRNA表達和乳腺組織上皮細胞中mRNA定位之間的正相關關系[15]。但到目前為止尚無研究表明乳腺中存在LAP蛋白。因此，有研究者使用兔子做免疫組化試驗，結果表明，LAP在健康的肺泡上皮細胞和乳汁中表達[16]。同時有多項研究表明，LAP是由肺泡上皮細胞分泌到乳汁中，并且對大腸桿菌有抗微生物活性。研究者在探索牛乳中LAP與乳腺炎、乳牛乳房內脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、革蘭陰性細菌細胞膜成分對牛乳中LAP濃度的變化的關系時發現，SCC在LPS刺激后2 h開始增加，并保持其高水平直到第5天；乳汁中LAP濃度在LPS 刺激2 h后顯著升高，并維持2 d的較高水平[16]。有研究證明，牛奶中的LAP濃度與SCC之間存在顯著相關性[17]。這些結果表明，一些細菌成分可以刺激β-防御素分泌到牛奶中。

然而，在Swanson等人的研究中，在注入乳房鏈球菌野生菌株感染乳腺后，對乳房周圍和外部組織進行分析，以及Roosen等人研究了臨床診斷為乳腺炎的外部和實質器官，都表明LAP僅在感染牛中表達。值得注意的是牛的飲食類型也影響著LAP在乳房中的表達水平，根據報道，高濃縮飼料可以提高LAP表達水平[18]。根據LAP和SCC之間的顯著相關性可以判斷在感染了金黃色葡萄球菌、牛鏈球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的牛乳之中LAP表達量比未感染的更高[19]。根據這些基礎研究，LAP被確定為牛乳腺炎關聯的遺傳標記之一。

1.2.2 TAP TAP是首個從哺乳動物氣管黏膜分離出的β-防御素[5]。TAP前原肽有64個氨基酸，包含20個氨基酸的信號肽和1個短的前序列(FTQGVG)。TAP還可以被多種病原體以及促炎因子，例如TNF-α、IL-1β 和LTA( Lipoteichoic acid )誘導。除此之外，LPS也可以增加TAP表達水平。根據報道它在健康和感染牛的乳腺細胞中都有表達，不僅如此，TAP在體外感染金黃色葡萄球菌的牛黏膜上皮細胞中也有表達[20]。

1.2.3 DEFB1 DEFB1 mRNA在感染的泌乳組織和非泌乳組織中存在，且在乳腺組織中呈現誘導性表達。DEFB1V1和DEFB1V2是BNBD1的兩個變體，是乳腺感染后誘導表達的防御素之一[21]。

1.2.4 DEFB4 DEFB4也被稱之為BNBD4，在1993年被首次報道牛肺泡組織中有較高水平的表達，但在小腸組織中表達水平較低[10]。一項研究表明，感染金黃色葡萄球菌后DEFB4在乳腺泡和乳池中呈現高水平表達[22]。DEFB4內含子區域內部分單核苷酸多肽被發現與乳汁成分性狀和SCC有關，因此，DEFB4可以確定作為乳腺炎抵抗力的標記。有研究證明，當細菌感染牛乳腺細胞后就會激活奶牛巨噬細胞內的維生素D通路，隨后1，25-二羥基維生素D3的活性激素刺激牛單核細胞的一氧化氮和β-防御素，使DEFB4表達水平提高[23]。

1.2.5 DEFB5(BNBD5) DEFB5與DEFB4類似，在牛肺泡表面巨噬細胞呈現高水平表達[24]。研究表明，奶牛感染乳房炎時BNBD5的mRNA表達水平升高。患有乳房炎的乳腺組織中BNBD5表達量比平時升高約13倍[25]。另一個研究證明，在乳腺感染金黃色葡萄球菌時DEFB5表達水平比DEFB4的更高。同樣的，凝固酶陽性葡萄球菌對乳腺中DEFB5的表達水平的影響高于凝固酶陰性葡萄球菌，不同的是DEFB4在泌乳早期也呈現這種高水平表達[26]。但遺憾的是，關于BNBD5的研究中目的蛋白的大量獲得和最終有明顯抑菌作用的純化蛋白研究報道較少。

1.2.6 DEFB10 相比較而言，感染凝固酶陽性葡萄球菌的乳腺組織第1～2次泌乳中DEFB10的表達水平比第3～4次泌乳更高[25]。而DEFB1、DEFB4、LAP和DEFB5在第3～4次泌乳表達水平更高[25]。此外研究表明，乳汁中嗜中性粒細胞在經過LPS處理后，DEFB10基因表達也出現升高現象[27]。

1.2.7 DEFB103 DEFB103是在27號染色體上新發現的β-防御素，它與D簇上其他的β-防御素幾乎沒有同源性，對于它在牛上的表達研究極少。根據文獻記載DEFB103多態型的四種單倍體與金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎的耐藥性和易感性并沒有顯著關聯[28]。

2 牛β-防御素的作用機制

近年來，不管人還是動物體內，多重耐藥性和抗生素耐藥性已成為趨勢。但有趣的是，防御素并沒有這方面現象，其中一個可能存在的原因就是防御素在該位置只有少量存在或者一般情況下防御素為隱形存在，當到達作用部位時才發揮作用[29]。根據報道，β-防御素作為兩親性陽離子肽，對于革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、病毒、真菌和其他單細胞寄生蟲可以作為抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)發揮作用[30]。

起初，肽通過靜電吸引力或者由膜上存在的受體介導與病原體的膜相互作用，在抗微生物肽達到閾值濃度后使細胞透化，隨后肽的構像轉變。而在某些情況下，膜帶負電荷時這種相變才是可行的。這也再次指出防御素區分宿主細胞和靶向細胞的能力[31]。透化之后開始最初的結合和相互作用。

3 牛β-防御素的應用展望

在乳腺炎防治中β-防御素的使用可以提高飼養奶牛動物福利以及減少農民飼養經濟成本。研究關于奶牛乳腺炎的β-防御素對社會具有相當重要的實用價值，可以為奶牛乳腺炎防治提供新思路，從而促進全球奶牛養殖的健康發展。

3.1 調整飲食從而對β-防御素表達產生影響 營養物質對個體免疫系統有較大的影響，但就β-防御素來說，不同膳食條件下宿主防御肽(Host defense peptides，HDPs)不同。對于人類，膳食組蛋白脫乙酰酶抑制劑蘿卜硫素和丁酸鈉被報道用來上調HDPs人類β-防御素-2在Caco-2、HT-29和SW480的表達。在感染大腸桿菌的仔豬，丁酸鈉促進HDPs的高表達，并且在此水平下大腸桿菌數量降低[32]。因此，飲食本身有助于更好地抵抗乳腺炎，降低醫療費用。

3.2 建立肽庫加速防御素發展應用 牛β-防御素種類已經發現很多，我們可以進一步利用其生物信息建立肽庫來全面快速發展防御素在實際生產中的應用。

3.3 根據防御素標記挑選優勢奶牛品種 根據前人研究可知，β-防御素可以作為乳腺炎關聯遺傳標記，并根據此標記對奶牛品種進行人工篩選，選出對乳腺炎抵抗力強的品種進行人工繁育。從而達到乳腺炎優勢品種對抵抗力較弱的品種的替代。從而減少奶牛患乳腺炎概率，最終達到減少經濟損失的目的。

3.4 替代抗生素 抗生素作為迄今為止治療乳腺炎的主要手段仍存在重復使用和不當使用的問題，導致近年來抗生素使用效力大幅降低。因此，在未來乳腺炎的治療中可以考慮利用宿主對抗感染過程中激發的天然免疫所產生的β-防御素作為未來治療β-防御素的一個潛在工具。因為這些防御素的靶向目標是微生物的整體結構，并且它們是通過調節免疫結構發揮作用[33]。故微生物并沒有對β-防御素產生耐藥性。另一個原因就是β-防御素特異性強，廣泛分布于體內，更有益與其在生產實踐中的應用。

3.5 作為佐劑改善疫苗 乳腺預防疫苗是國內外時下的討論熱點，而β-防御素是疫苗佐劑的理想候選物。目前對于人類和禽類的β-防御素作為疫苗佐劑方面研究較多，但在奶牛方面還有較大的研究空白，仍需我們積極研究探索。牛β-防御素的肽可以刺激Th1和Th2應答以及傳遞免疫佐劑[34]。Mackenzie-Dyck等人表明牛皰疹病毒1疫苗就由BNBD3和糖蛋白D作為佐劑制備的[35]。