豬寡腺苷酸合成酶OAS 1a基因熒光定量SYBR Green檢測方法的建立與運用

李存法 ， 王瑞寧 ， 李華瑋 ， 馮麗麗 ， 張二芹 ， 張 雅 ， 何 健 ， 趙孟孟

(1.河南牧業經濟學院制藥工程學院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2. 河南牧業經濟學院生物工程學院 ， 河南 鄭州 450046 ；3. 河南省農業科學院農業經濟與信息研究所 ， 河南 鄭州 450002 ； 4.河南農業大學牧醫工程學院 ，河南 鄭州 450002 ; 5.佛山科學技術學院生命科學與工程學院 ， 廣東 佛山 528000 )

豬繁殖與呼吸綜合征是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引發的一種烈性，高度接觸性傳染病，臨床癥狀主要是流產、死胎、木乃伊胎以及各種呼吸道癥狀。該病在我國于1986年首次報道，之后全國流行，2006年暴發，對我國養豬業造成重大損失，已成為養豬業頭號危害。由于該病毒是RNA病毒，變異速度快，一直未有有效的疫苗和藥物防控該病。

2′,5′-寡腺苷酸合成酶是干擾素刺激產生的一種具有抗病毒活性的干擾素促進基因，最初于1976年報道。病毒感染后產生的IFN能使細胞內2′,5′-寡腺苷酸合成酶蛋白量增加上千倍，2′,5′-寡腺苷酸合成酶通過活化RNase L酶引發病毒和細胞的RNA發生降解，從而殺死病毒及其感染的細胞[1-2]。該蛋白在人，豬，牛等多種動物身上都有分布[3-6]。豬寡腺苷酸合成酶家族主要包括OAS1a，OAS1b，OAS2，OASL，其中豬OAS1a有報道具有抗病毒效果[7]，檢測OAS1a的表達情況有利于檢測機體的免疫特征，為分析機體病毒感染情況，以及免疫調控與免疫逃逸提供參考[8-11]。

針對豬2′,5′-寡腺苷酸合成酶的檢測方法一直未見報道，本研究通過熒光定量方法建立一種檢測豬OAS1a表達量的方法，為臨床檢測免疫特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞 PAM細胞為農業部獸用疫苗創制重點實驗室保存。

1.2 病毒 PRRSVCH-1R病毒為農業部獸用疫苗創制重點實驗室保存。

1.3 試劑 RNA提取試劑TRIZol，購自Life Technology公司；反轉錄試劑盒RT reagent Kit；with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、pMD18-T載體、SYBER 熒光定量預混劑，PCRExTaq酶預混劑,購自寶生物工程(大連)有限公司；Poly(I ∶C),購自Invivogen公司;干擾素,購自Pepro-Tech公司;無病原菌豬的臟器：心、肝、脾、肺、腎、腦、淋巴結、腸為農業部獸用疫苗創制重點實驗室保存。細胞培養用1640和胎牛血清,購自GIBCO公司;含有IRF3、IRF7、 RIG-1的標準質粒為農業部獸用疫苗創制重點實驗室保存。

1.4 主要儀器： PCR儀器,購自寶生物工程(大連)有限公司;熒光定量儀器7500，購自ABI公司。

1.5 方法

1.5.1 引物設計 根據豬寡腺苷酸合成酶OAS1a基因的序列設計定量引物，其中上游引物序列為：5′-TATGAATTCAATGGGAAACTGGGGGTCCC-3′，下游引物為：5′-CGCGACGACTCAGTCCATGAATCTCC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 RNA提取與反轉錄 從PAM細胞以及豬的各種組織提取RNA，RNA提取步驟以及反轉錄步驟參照試劑盒步驟，具體參照文獻[12]。

1.5.3 PCR反應體系ExTaq酶預混劑25 μL，上下游引物(10 pm)各1 μL，模板2 μL，水21 μL，其他具體參照文獻[13]。

1.5.4 pMD18-T載體構建 PCR產物經凝膠電泳之后，經過膠回收試劑盒純化，連接pMD-18-T載體，4 ℃過夜連接，之后轉化，挑取單菌落，搖菌，提質粒，具體步驟參照文獻[14]。

1.5.5 測序 菌液PCR鑒定陽性質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.6 病毒感染 PAM細胞以2×105/孔的密度鋪在1640培養液中，以MOI=1的病毒劑量感染細胞，分別在不同時間點0 h，6 h，12 h，24 h，36 h，48 h收樣，提取RNA，并進行反轉錄。

1.5.7 干擾素處理 PAM細胞以2×105/孔的密度鋪在1640培養液中，以1 000單位干擾素處理細胞，分別在不同時間點0，6，12，24，36，48 h收樣，提取RNA，并進行反轉錄。

1.5.8 不同臟器組織取樣 將健康豬的不同組織：心、肝、脾、肺、腎，腦、腸、淋巴結，取樣，研磨處理，反復凍融之后提取總RNA，并進行反轉錄。

1.5.9 熒光定量反應 熒光定量反應體系為10 μL qPCR 預混劑，上下游引物各0.2 μL，模板2 μL，水13 μL，95 ℃ 預變性15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，反應40個循環。

1.5.10 數據處理 所有樣品結果與標準曲線對比，計算拷貝數，用GraphPad Prism軟件制作圖表。

2 結果

2.1 擴增曲線與敏感性結果 將標準質粒換算濃度之后計算拷貝數，倍比稀釋之后qPCR反應生成擴增曲線，結果可見曲線平滑，擴增效果良好，結果見圖1。敏感性試驗結果表明,該試驗方法的1 000～1 000 000拷貝數均有擴增，最低拷貝數100無擴增曲線，最低敏感性為100拷貝，結果見圖2。

圖1 擴增曲線

圖2 敏感性試驗

2.2 標準曲線結果 在擴增曲線生成之后，儀器自動生成標準曲線，結果見圖3，該曲線重合率R2在98.9%，表明曲線重復性良好。

2.3 熔解曲線與特異性結果 qPCR反應結束之后，儀器自動生成熔解曲線，熔解曲線結果可見單峰，表明引物效果良好。將含有IRF3，IRF7， RIG-1 的質粒作為模板進行PCR反應，除了含有OAS1a的目的質粒有擴增曲線以外，其余均未有擴增，表明引物特異性良好。

圖3 標準曲線

2.4 組織分布結果 將豬不同組織提取RNA之后進行qPCR反應，結果表明OAS1a基因在多個組織中均有分布，以肝臟和淋巴結最多。

2.5OAS1a在病毒感染過程中表達變化結果 將PRRSV病毒感染細胞，在不同時間點采集細胞，收樣，測定拷貝數，結果表明,OAS1a基因在病毒感染過程中表達量逐步升高，36 h達到最高。

圖4 OAS 1a基因在不同組織中的分布

圖5 OAS 1a基因在PRRSV感染過程中的表達變化

2.6 干擾素處理細胞基因表達變化結果 干擾素處理細胞后，OAS1a基因表達量迅速升高，6 h達到最高，之后有所下降，結果見圖6。

圖6 OAS 1a基因在干擾素處理過程中的表達變化

干擾素誘導劑Poly(I ∶C)用同樣方法處理細胞之后，在4 h誘導期，該基因表達量也迅速升高，結果見圖7。

圖7 OAS 1a基因在Poly(I ∶C)處理過程中的表達變化

3 討論

2′,5′-寡腺苷酸合成酶蛋白(2′,5′-Oligoadenylate synthetase protein，OAS)是IFN誘導產生的具有抗病毒活性的一種ISG，該酶家族在IFN抗病毒過程中具有重要作用，同時也參與凋亡及生長等其他細胞行為。病毒感染后產生的IFN能使細胞內OAS蛋白量增加上千倍。在雙鏈RNA(dsRNA)活化后，OAS使ATP寡聚體化生成從二聚體到30聚體不等的2′-5′連接的寡腺苷酸(2-5A)。2-5A與RNase L緊密結合后，使得RNase L形成二聚體而被激活。在病毒感染的細胞中，RNase L引發病毒和細胞的RNA發生降解，從而殺死病毒及其感染的細胞。在人體細胞中，IFN能夠誘導產生4種類型的OAS：小型的p42/p46 OAS(OAS1)、中型的p67/p71 OAS(OAS2)、大型的p100 OAS(OAS3)及類OAS蛋白p59(OASL)。小型的OAS也存在于哺乳類動物中，人的p59蛋白(OASL)不具有合成2-5A的活性，鼠DC細胞中也存在同源的OASL蛋白。

在沒有IFN的情況下，大多數細胞或組織中OAS的濃度都非常低。在多數情況下，要分離OAS蛋白，就要用IFN對細胞培養物進行處理。2-5A最早出現在1978年，當時它被描述為一種低分子量的蛋白合成抑制劑。之后，在IFN處理的細胞提取物及兔網狀細胞裂解液中，合成酶OAS(2-5A Synthetase)及雙鏈RNA依賴的蛋白激酶PKR同時被發現。1987年，Chebath等為2-5A系統(2′-5′-Oligoadenylate system；OAS system)參與IFN抗病毒效應提供了最初的證據。

本試驗建立了豬寡腺苷酸合成酶的熒光定量檢測方法，為首次報道。該方法簡便，特異性好，并檢測到該基因在豬不同組織中的分布，證明肝臟和淋巴結中分布較多，原因可能是該組織主要是含有較多的免疫細胞，免疫反應較強烈。另外證明干擾素處理之后，該基因大量表達，進一步證明該基因是干擾素促進基因。另外在PRRSV病毒感染過程中，該基因不斷升高，與之前的文獻報道一致[15]。不同的是一個是蛋白水平，一個是mRNA水平，原因可能是病毒感染促進了干擾素的表達，干擾素進一步促進該基因的表達，也從側面進一步證明PRRSV感染可以激活干擾素這個結論。另外，推測其他病毒感染可能也會激活該基因的表達，預計該基因可以作為機體免疫反應被激活的一個證明[16-19]。

已經有報道，其他物種的OAS1a在病毒感染之后都有升高，如Tembusu virus[20]等病毒。在人體上該基因也被作為檢測機體免疫特征的檢測指標，并且有商品化的ELISA檢測試劑盒，但是在動物上還未有報道。

本試驗建立的方法為檢測豬寡腺苷酸合成酶提供了參考，有利于檢測機體的免疫特點。