牦牛卵巢顆粒細胞中Bmal1基因的表達試驗

趙明旺 ， 張 君 ， 徐尚榮 ， 彭 巍 ， 舒 適 ， 黃 榮 ， 張琳欽 ， 關凱文

(1.青海大學農牧學院 ，青海 西寧 810016 ; 2.青海大學畜牧獸醫科學院 ， 青海 西寧 810016)

生物節律指動物為了適應環境，在生命活動中，從分子、細胞到機體等不同層次上都有明顯的時間周期現象[1]，包括近日節律和長日節律。而近日節律是最重要的一種生物節律，是以近似24 h為周期的自主維持振蕩器，主要受生物鐘基因的調控，包括Bmal1(Brainandmusclearnt-like1，Bmal1)，Clock(Circadianlocomotoroutputcycleskaput，Clock)、Per(Period，Per)和Cry(Cryptochrom，Cry)等。其中，Bmal1是調控節律基因的核心元件，能和Clock形成異二聚體，并與其他鐘基因(如Per、Cry等)啟動子區的E-box元件結合，驅動這些基因的表達，從而調節生物體的生命活動。哺乳動物的生物鐘基因最早被定位于下丘腦視交叉上核(Suprachiasmatic nuclei，SCN)， 但隨著研究的深入，學者們發現生物鐘基因在其他外周組織中也有表達[2-4]，說明生物鐘基因除了在生物節律中起作用外，在動物機體其他代謝中也發揮著重要的作用。研究指出，生物鐘基因在丘腦-垂體-性腺系統軸的組織中表達，參與調節性腺的發育和功能[5-6]。同時有研究發現，在卵泡合成孕酮的過程中，類固醇激素合成急性調節蛋白(StAR)和3β-羥化類固醇脫氫酶(3-βHSD)呈現晝夜節律性表達，對其啟動子區的分析發現存在Bmal/Clock的作用靶點E-box[7]。Bmal1對動物黃體的形成和孕酮(P4)的分泌，甚至對動物的排卵周期以及胚胎發育都有影響[8-9]。這些研究說明生物鐘基因參與動物的生殖調控，對動物的繁殖有一定的影響。因此，研究生物鐘基因在動物生殖系統中的表達規律與功能，對畜牧業的發展具有重要意義。

牦牛(Bosgrunniens)作為高原地區農牧民的主要生活和生產資料，其所處的環境特殊，繁殖性能低下，近年來關于牦牛繁殖性能的研究頗多，但有關牦牛卵巢顆粒細胞中是否存在生物鐘基因尚未見有關報道。因此，本試驗以分離培養的母牦牛卵巢顆粒細胞為研究對象，分離培養卵巢顆粒細胞，運用免疫熒光對Bmal1蛋白表達進行定位，并用qRT-PCR技術檢測該基因在不同培養時間牦牛顆粒細胞中的表達情況，以確定Bmal1基因的節律性表達規律，為下一步研究Bmal1對牦牛顆粒細胞生物學功能的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 西寧市裕泰屠宰場健康母牦牛。用滅菌剪刀剪取卵巢，生理鹽水沖洗干凈，置于盛有36 ℃生理鹽水及雙抗的保溫杯中。

1.1.2 主要試劑 DMEM、10%胎牛血清，購自Gibico公司；地塞米松購自Sigma公司；TransZolUp Plus RNA Kit、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，購自北京全式金生物技術有限公司；Bmal1兔多克隆抗體購自Abcam公司；反轉錄試劑盒、Green Premix，購自大連寶(TaKaRa)生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養箱，為美國Thermo產品；倒置熒光顯微鏡，為Nikon產品；核酸蛋白儀，為Thermo產品；普通PCR儀，為Eppendorf產品；電泳儀，為Hoefer公司產品；凝膠成像系統，為天美(中國)科學儀器有限公司產品；qRT-PCR儀(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System)，為Applied Biosystems產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI數據庫中已知的牦牛Bmal1(登錄號：XM_014477271.1)基因序列和內參基因GAPDH(登錄號：XM_014482068.1)引物序列，利用Oligo7.0軟件設計熒光定量引物(見表1)。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 Bmal 1和GAPDH引物序列

1.2.2 牦牛卵巢顆粒細胞的分離 從屠宰場采集健康的牦牛卵巢，在2-6 h內送回實驗室細胞間內。剪掉卵巢上的結締組織，用生理鹽水清洗3次。吸取卵泡液于盛有5%胎牛血清(FBS)的15 mL離心管中，常溫離心5 min(1 200 r/min)，棄去上清液。用加有雙抗的PBS離心清洗重復5次。細胞篩過濾,得到較為純凈的牦牛顆粒細胞。

1.2.3 牦牛顆粒細胞體外培養 將處理好的牦牛顆粒細胞按照適當的細胞濃度，在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM基礎培養基，分別裝入細胞瓶中，于5%CO2，95%空氣，37 ℃，飽和濕度的培養箱中培養。24 h之后觀察細胞生長情況，棄掉原培養基，用PBS清洗3遍，再換上新的培養基繼續培養。48 h后細胞長滿瓶底時，進行細胞傳代：棄掉原有培養基，PBS清洗3遍，向每個細胞瓶中加入1 mL胰酶消化5 min后，等量的血清終止消化，吹打混勻離心(1 200 r/min，5 min)；向每管細胞沉淀中加入500 μL培養基，混勻，集中于15 mL離心管中，混勻，細胞計數；按照計數好的細胞濃度，平均分裝至35 mm平皿中，并加入1 mL培養基進行培養，細胞數為每個平皿105個。

1.2.4Bmal1基因在顆粒細胞中的定位 當原代細胞生長至平皿90%時，胰酶消化，制備單細胞懸液，將4×105個/mL的細胞懸液注入放有8 mm圓形載玻片的35 mm細胞培養皿中，培養箱中培養24 h，細胞長至貼壁面近80%時，取出細胞爬片，用PBS沖洗3遍(1 min/遍)，4%多聚甲醛固定15 min，進行細胞免疫化學染色：PBS清洗3遍；0.4%Triton通透細胞膜10 min，隨后以即用型正常山羊血清封閉30 min，然后加入一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，室溫避光1 h；最后加入1 mg/L的Hoechst33258，室溫5 min，熒光顯微鏡下觀察。同時用PBS代替一抗作陰性對照

1.2.5Bmal1基因節律性的體內模擬試驗 傳代細胞培養24 h后，根據文獻，地塞米松能夠模擬體內節律性，本試驗向每個平皿中加入100 nM的地塞米松處理2 h[10]，棄掉原含有地塞米松的培養基，PBS清洗3遍，換入新的培養基繼續培養。從加入新的培養基開始，每隔4 h(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)進行細胞收集并提取RNA。每個試驗設置3個重復。

1.2.6 顆粒細胞RNA的提取和cDNA的合成 對顆粒細胞的總RNA進行提取，提取方法按照TransZolUp Plus RNA Kit試劑盒說明書進行。取6 μL提取的RNA經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用核酸蛋白儀檢測RNA濃度。cDNA合成各組RNA的量為700 ng，轉錄方法按照說明書進行。得到的cDNA分別作為常規PCR和qRT-PCR的模板，并放置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.7 常規PCR檢驗Bmal1引物的特異性 PCR反應體系為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 6.5 μL，cDNA 2 μL。反應程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 min，退火30 min(退火溫度見表1)，72 ℃ 30 min，35個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產物經2%瓊脂凝膠電泳進行試驗：電壓100 V，時間30 min。

1.2.8 qRT-PCR 分別檢測Bmal1在24 h內不同時間點的表達量。反應體系為20 μL：Premix 10 μL、Dye 0.4 μL、ddH2O 6 μL、上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL；反應條件參照產品說明書。每組試驗樣品重復4次試驗，每個樣品的目的基因和內參基因GAPDH分管同板以相同條件擴增。

1.2.9 數據處理 用2-△△Ct法對數據進行處理。用余弦分析軟件進行基因的節律性分析，并獲取節律性參數。IBM SPSS Statistics 19.0統計軟件進行數據分析，組內差異進行t檢驗，同組不同時間點的數據用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。所有數據以“均數±標準差”表示。

2 結果

2.1Bmal1在牦牛顆粒細胞中的定位表達 對牦牛顆粒細胞進行免疫熒光染色，紅色為目的蛋白標記，藍色為細胞核標記。結果(見中插彩版圖1)顯示，體外培養細胞已經貼壁，經過免疫組化染色紅色標記后得知，Bmal1蛋白在牦牛顆粒細胞的細胞質中表達分布。

圖1 Bmal1蛋白在牦牛顆粒細胞中的表達A：正常鏡下的顆粒細胞 ； B：目的蛋白熒光染色 ； C：細胞核染色 ； D：合并

2.2 牦牛卵巢顆粒細胞總RNA的提取 用核酸蛋白儀檢測提取的RNAOD260/OD280的比值均在1.8～2.0之間，說明RNA純度高。再經過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結果顯示，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見(圖2)，說明提取的總RNA完整性強，無降解。兩者結果表明，提取的RNA均符合要求，可以用于后續試驗。

2.3 常規PCR檢驗引物的特異性 取5 μL擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，電壓100 V，時間30 min，在瓊脂糖凝膠成像系統清晰觀察到在膠上119 bp和140 bp處均為單一條帶，說明引物特異性好并且與預期的片段長度是相符的(圖3)，引物可用于后續試驗工作。

圖2 總RNA提取結果
M：DNA標準 DL-2 000 ； 1～3：牦牛卵巢顆粒細胞總RNA電泳圖

圖3 Bmal1和GAPDH的擴增結果
M：DNA標準 DL-500 ； 1～2：Bmal1 ； 3～4：GAPDH

2.4Bmal1在顆粒細胞中不同時間段的表達量分析 地塞米松模擬試驗處理后，在體外培養24 h內不同時間點Bmal1基因在顆粒細胞的相對表達量見表2。對Bmal1基因在不同時間點的相對表達量數據用余弦分析系統進行余弦分析，發現Bmal1的表達呈規律性(P<0.05)，且振幅為0.28，表達趨勢見圖4。

表2 不同培養時間點Bmal1的相對表達量

注：以4 h的測量值作為基準 ， *表明基因表達呈規律性，P<0.05

圖4 Real Time-PCR檢測Bmal1在24 h內不同時間點表達量

3 討論

Bmal1除了在哺乳類動物下丘腦視交叉上核(SCN)、松果體和視網膜中表達以外，在外周組織，如心臟、肝臟、腎臟、睪丸等組織中也有表達[11-12]。在小鼠妊娠第1-4天子宮、輸卵管以及未受精的卵母細胞中可檢測到Bmal1的表達，而受精后，Bmal1的表達水平降低，表明該基因在小鼠胚胎早期發育中起到一定的作用[13]。George 等[14]采用免疫組化對小鼠卵巢生物鐘蛋白進行表達研究發現，小鼠的卵巢中不僅存在生物鐘基因，在不同卵泡期中的表達量也存在差異，表明鐘蛋白在卵巢成熟中有著重要的作用。本研究通過免疫熒光對Bmal1在牦牛顆粒細胞中的表達定位，確定了牦牛顆粒細胞中存在Bmal1基因。為后期研究Bmal1基因在牦牛顆粒細胞的功能研究提供理論依據。

哺乳動物的許多生理過程和行為都是有節律的，這些節律是由位于哺乳動物SCN內的內源性分子鐘所調控的。SCN作為生物節律的起搏器，通過接收來自外界環境的刺激信號，以體液和神經調節的形式使存在于全身周圍組織(如，卵巢等)中的無數輔助振蕩器同步，從而調節動物機體的生理及代謝過程[15-16]。哺乳動物生物鐘分子模型的核心是節律基因的轉錄翻譯反饋環路，反饋環路中激活因子和抑制因子的相互作用通過轉錄翻譯的正、負反饋調節，使節律基因呈現24 h的節律性變化，從而調節動物機體在24 h內不同時間段的生理代謝[17]。研究認為，卵泡膜細胞是調節動物排卵時間和幅度的重要振蕩器，當有條件的對卵泡膜中的Bmal1基因的節律性表達進行干擾，雌性小鼠的排卵發生絮亂[18]。說明生物鐘基因在雌性動物生理周期性代謝中發揮著重要作用。Wusu Wang[10]等通過研究豬卵巢顆粒細胞生物鐘基因表達情況發現，經地塞米松處理后，在體外培養不同時間點的豬顆粒細胞中，Bmal1和Per2都有著明顯的時鐘節律性表達。我們通過試驗證實了牦牛卵巢顆粒細胞中存在Bmal1基因，并假設該基因在牦牛顆粒細胞中呈一定的規律性表達。本研究利用qRT-PCR技術，檢測24 h內不同體外培養時間點牦牛卵巢顆粒細胞中Bmal1基因的表達情況，結果顯示，Bmal1的表達呈現一定的規律性，這與Chen[19]等的研究結果一致。這種規律性是動物機體在適應外界環境如：晝夜交替、光照、氣溫變化等因素而形成的由生物鐘基因調控的機制[20-21]。試驗表明，牦牛顆粒細胞中存在著近日節律分子機制，根據結果可推測牦牛顆粒細胞中的Bmal1可能通過節律性地調控牦牛卵巢的生物代謝功能。Bmal1基因呈現的表達節律性是否對牦牛顆粒細胞激素分泌和顆粒細胞增殖、凋亡有所影響，還需要進一步研究。

4 結論

本試驗結果表明，牦牛顆粒細胞中存在生物鐘基因；且Bmal1基因在體外24 h內不同培養時間點的牦牛顆粒細胞中呈規律性表達，說明牦牛卵巢顆粒細胞中存在時鐘節律分子機制。試驗結果為進一步對牦牛顆粒細胞中的生物節律功能研究提供理論基礎。