某牛場巴氏桿菌的分離鑒定

袁廣富 ， 肖 娜 ， 張增賢 ， 劉 瑩 ， 左玉柱 ， 范京惠

(1.河北農業大學動物醫學院 ， 河北 保定 071001 ; 2.河北省定州市動物防疫監督總站 ， 河北 定州 073000 ;3.河北省寧晉縣畜牧獸醫管理辦公室 , 河北 寧晉 055550)

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病，又稱牛出血性敗血癥。牛巴氏桿菌最早發現于1881年，被認為與多種野生動物和家養動物疾病相關[1]，牛巴氏桿菌分為5個莢膜型(A,B,D,E,F)和16個血清型(1～16)[2]。2010-2011年重慶市多個牛場發生牛巴氏桿菌感染致死病例[3]。2010-2012年在吉林省規模化牛養殖場的病牛中發現了牛巴氏桿菌的感染[4]。

本試驗根據采集死亡牛的肝臟、腎臟、脾臟，經過菌落形態觀察、培養特性，進行病原菌的分離純化及PCR鑒定，并對鑒定的病原菌進行藥物敏感性分析，以確診該牛場牛群發病原因，挽救患牛生命，保障牛場的經濟不受損失，為減少疫病的發生提出防治措施。

1 材料與方法

1.1 病料 河北省衡水市某奶牛場無菌采集發病死亡奶牛的肝臟、腎臟、脾臟送至河北農業大學動物醫學院預防獸醫實驗室檢測。

1.2 培養基、試劑及儀器 血清瓊脂平板培養基、LB液體培養基，由河北農業大學動物醫學院預防獸醫實驗室配制；革蘭染色液，購自濰坊市康華生物技術有限公司；膠回收試劑盒、DL-2 000 DNA Marker(MD114)，購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；光學顯微鏡，購自尼康(Nikon)公司；2×TaqPCR Mix，購自中科瑞泰生物科技有限公司；BIOWEST瓊脂糖，購自上海玉博生物技術有限公司；Neofuge 13R高速冷凍離心機，購自上海力申科學儀器有限公司；PCR擴增儀，購自深圳市宇德立生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀，購自北京市六一儀器廠；Protein simple凝膠成像系統，購自普諾森生物科技(上海)有限公司；HWS智能型恒溫恒濕培養箱，購自寧波江南儀器廠。

1.3 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 通過對牛場工作人員的詢問記錄該牛場患牛的臨床癥狀；對患病死亡牛進行剖檢，觀察患病牛組織病理變化并記錄。

1.4 病原菌的分離與培養 無菌采集死亡牛肝臟、腎臟、脾臟的病健交界處剪取一小塊組織樣本，同時無菌接種于血清瓊脂平板培養基、麥康凱瓊脂培養基、血液瓊脂培養基和普通瓊脂培養基后，置于37 ℃恒溫培養箱過夜，進行細菌分離培養。用接種環挑取一單菌落涂于載玻片上，按照革蘭染色液的說明書進行革蘭染色并鏡檢，在光學顯微鏡下觀察菌落形態，對分離菌進行初步鑒定。再挑取一單菌落，將單菌落接種至LB-血清液體培養基中，37 ℃振搖培養20 h，備用。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 引物設計與合成 利用Primer 5.0 引物設計的軟件，根據GenBank上細菌的基因序列進行同源性多重比對并獲得其保守區設計一對通用PCR引物，引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成(見表1)。

表1 通用引物信息

1.5.3 瓊脂糖凝膠回收 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段，在UV透射儀下，將目的片段從膠上切下放入離心管中，加入1倍體積的Buffer GC,60 ℃水浴10 min至膠融化。根據寶日醫生物技術(北京)有限公司的膠回收試劑盒說明書進行目的片段回收純化，最終獲得的膠回收產物。

1.5.4 PCR擴增序列分析 將最終獲得的膠回收產物送至北京中科希林生物科技有限責任公司進行測序，測序結果在NCBI進行同源性比較。

1.6 藥敏試驗 在無菌操作臺中吸取已鑒定后培養的菌液50L，分別轉移至3個血清瓊脂培養基中并均勻涂開，用鑷子夾取21種藥敏紙片，每個血清瓊脂培養基表面按壓7種藥敏紙片，并做好標記，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，用游標卡尺量取抑菌環直徑，參考美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)動物源細菌藥敏試驗標準，分別以敏感、中介和耐藥3種形式對藥物敏感性進行分析。

2 結果

2.1 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 患病牛發病初期體溫升高，達到41.3～42.5 ℃，心跳加快，皮溫不整，精神不振，食欲減退或廢絕，氣喘流涎，鼻鏡干裂，被毛粗亂，病牛會出現腹痛，偶爾會出現空嚼癥狀，嚴重時病牛出現呼吸困難，呼吸頻率加快，全身衰弱，倒地俯臥。對患病牛進行剖檢可見，皮下組織及肌肉均有出血點，脾臟有點狀出血，但不腫脹；肝臟和腎臟有實質性變性；胸腔內有大量纖維素性滲出物存在；淋巴結腫大、出血。

2.2 病原分離培養 病料接種至血清瓊脂培養基上生長良好，經過16 h后生長為光滑、濕潤的圓形菌落；病料接種至麥康凱瓊脂培養基上不生長細菌；病料接種至血液瓊脂培養基上生長像露珠一樣的小菌落，無溶血現象；病料接種至普通瓊脂培養基上生長貧瘠，生長狀況較差。挑取生長良好的單一菌落，經過革蘭染色鏡檢為革蘭陰性短桿菌。

2.3 PCR鑒定結果 經過PCR擴增，結果顯示，擴增出現的目的條帶與預期目的條帶大小一致(見圖1)；將牛巴氏桿菌的陽性擴增產物送至北京中科希林生物科技有限責任公司進行測序，將16S rDNA測序結果在NCBI上進行BLAST分析，與牛巴氏桿菌基因序列的同源性達99%，進一步確定送檢患病牛感染巴氏桿菌。將測序結果與GenBank中公布的JQ404475、JQ726501、JQ975927、JQ975948、JX975443、JX975446相應的16S rDNA序列進行比較，其同源性在98%～100%之間(見圖2、圖3)。

圖1 牛巴氏桿菌PCR擴增
M:DNA分子質量標準 ; 1-3：牛巴氏桿菌的PCR擴增產物

圖2 牛巴氏桿菌16S rDNA基因同源性

圖3 牛巴氏桿菌16S rDNA基因進化樹

2.4 耐藥性分析結果 本研究選擇21種藥敏片參考CLSI動物源細菌藥敏試驗標準，分別以敏感、中介和耐藥3種形式對已分離鑒定的病原菌進行耐藥性分析，分析結果見表2，從患病牛分離的巴氏桿菌對林可霉素、慶大霉素等13種抗生素不同程度耐藥；對頭孢噻肟、頭孢唑林、米諾環素、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考敏感。見表2。

表2 牛巴氏桿菌耐藥性分析結果 (mm)

3 討論

牛巴氏桿菌病是由于感染巴氏桿菌而引起的傳染病，又稱出血性敗血癥[5]，往往出現突然發病，有較高的死亡率。隨著養牛業的不斷發展，牛巴氏桿菌病對牛場造成極大的經濟損失，嚴重影響養殖戶的經濟效益[6]。

該牛場患病牛出現體溫升高，精神不振，反芻次數減少，反應遲鈍，呼吸困難，眼結膜潮紅等臨床癥狀，部分患病牛衰竭死亡，剖檢可見嚴重的肌肉及內臟出血。初步認定為牛巴氏桿菌感染，為對患病牛進行確診，將無菌采集發病死亡牛的肝臟、腎臟、脾臟進行一系列的檢測為陽性，并將陽性產物送至測序公司進行測序，與牛巴氏桿菌基因序列具有高度同源性，確診為牛巴氏桿菌病。

牛巴氏桿菌是一種短小、兩端鈍圓的球桿狀或短桿菌，多呈散在、無運動性，不形成芽孢，革蘭陰性，兩極濃染，又叫兩極桿菌至麥康凱瓊脂培養基上不生長細菌；至血液瓊脂培養基上生長像露珠一樣的小菌落，無溶血現象；至普通瓊脂培養基上生長貧瘠，生長狀況較差；至血清瓊脂培養基上生長良好，經過16 h后生長為光滑濕潤的圓形菌落[7]，并且與很多細菌的形態相似，但在生化反應上有所區別。

在本試驗中，牛巴氏桿菌對頭孢噻肟、頭孢唑林、米諾環素、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考敏感；而對環丙沙星、林可霉素等13種抗生素耐藥。通常情況下，臨床上治療牛巴氏桿菌病的抗菌藥物有環丙沙星、洛美沙星、紅霉素和阿奇霉素等[8],由于抗生素的長期不合理、不適量使用，導致牛巴氏桿菌對臨床多種抗生素都有不同程度的耐藥，并且菌株的耐藥性還在不斷增強[9]。2015年俸忠蘭等[7]對牛巴氏桿菌的耐藥性分析結果和2016年劉順磊等[10]對牛巴氏桿菌的耐藥性檢測都已經反映出由于超量的不適當使用，牛巴氏桿菌的耐藥程度越來越嚴重，并且嚴重影響了藥物的治療效果和養牛業的經濟效益[11-14]。

預防本病的關鍵在于平時注意改善舍內的通風和飼養管理，避免通風不良，實時監測牛群的健康狀況，按時進行疫苗接種，本病對該牛場造成極大的經濟損失，本試驗為確診該牛場牛群發病原因并提出恰當的防治措施，建議選擇敏感藥物進行用藥，加強飼養管理,保障養牛業的健康快速發展。