禽腺病毒-I群PCR-RFLP分型方法的建立

江之瑤 ， 王守春 ， 欒慶東 , 尹燕博 ， 王建琳

(青島農業大學動物醫學院 ， 山東 青島 266109)

禽腺病毒按照特異性抗原的不同可分為3個群，其中禽腺病毒-I群(Fowl adenovirus, FAdVs)共分為12個血清型(1～7、8a、8b、9～11)，FAdVs能引起禽心包積液綜合征、包涵體肝炎、肌胃糜爛和再生障礙性貧血等[1]。FAdVs不僅可以水平傳播，還可以垂直傳播，對家禽養殖業造成了巨大威脅[2]。目前，檢測FAdVs的經典方法主要有病毒的分離鑒定、病毒中和試驗等。在實際生產中，以分子生物為基礎的PCR檢測方法是進行病原測定的主要方法[3]，但單純的PCR檢測方法無法區分FAdVs的血清型，需要后續進行基因測序分析等。

自2015年以來，FAdVs感染在我國廣泛流行，尤其血清4型FAdVs給我國養禽業造成了巨大的經濟損失。我國FAdVs感染有多種血清型，為快速準確的區分不同血清型 FAdVs感染，為后續的有效防控提供依據，本試驗擬建立FAdVs的聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)分型方法，用于臨床FAdVs的快速分型。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體與細胞 FAdVs的12個血清型 (購自中國獸醫藥品監察所)；感受態細胞 DH5α和pMD18-T 載體(TaKaRa公司)。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F-12細胞培養液、胎牛血清、LB培養基、DNA Maker DL-2 000(TaKaRa公司)； DEPC水(北京索萊寶科技有限公司)；1×PCR Mix；DNAiso Plus(TaKaRa公司)；氯仿、異丙醇、乙醇(天津化學試劑三廠)。PCR基因擴增儀(TC-96/G/H(b)型，杭州博日公司)，電泳儀(JY600E型，君意東方公司)， 核酸電泳槽(JY-SPFT型，君意東方公司)，凝膠成像儀(JY04S-3C型，君意東方公司)，恒溫水槽(HH.S11-2型，上海博訊公司)，超純水儀(best-R型，上海芷昂公司)，離心機(Pico17型，ThermoFisher公司)，恒溫培養箱(XT5116-IN70型，雪中炭公司)。

1.3 限制性內切酶Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI、Psy I、BgⅡ(Thermo Fisher公司)。

1.4 引物設計與合成 根據GenBank中 FAdV-I的Hexon基因，應用Premier5.0軟件設計通用引物(表1)，并尋找酶切位點，引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

表1 Hexon基因擴增用引物

1.5 病毒核酸提取與PCR擴增 取細胞毒上清200 μL，加入700 μL DNAisoPlus、140 μL 氯仿。輕柔混勻，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心10 min,取上清500 μL，加入500 μL冷異丙醇。低溫靜置10 min。12 000 r/min離心 10 min 棄上清。加入1 000 μL冷75%乙醇，7 500 r/min離心5 min后棄上清，重復操作2次。室溫敞口干燥，確保乙醇揮發干凈后加入DEPC 水35 μL，輕彈，使核酸徹底溶解，置于-80 ℃冰箱備用。

PCR反應體系為PCR Mix 45 μL,模板1 μL，上下游引物各2 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR結束后，電泳鑒定連接載體并測序。

1.6 目的基因的酶切及圖譜分析 取PCR產物7 μL，加入DEPC 水10 μL，限制性內切酶1 μL，10×Fast Digest Buffer 2 μL。于恒溫箱中37 ℃酶切30 min。電泳確認酶切結果。

2 結果與分析

2.1 毒株擴增和測序結果 利用本試驗所設計的引物，經PCR擴增，FAdVs的12個血清型均得到了與預期條帶大小一致的片段，約894 bp(圖1)，連接載體測序結果為FAdVs(1～7、8a、8b、9～11)型。經序列分析，各毒株的片段與GenBank中所登錄的FAdVs的同源性和覆蓋率均為98%～100%。

圖1 12個血清型FAdV-I Hexon基因PCR擴增結果
M:DNA Marker DL-2 000 ; 1～12:FAV1-7、8a、8b、9-11PCR產物

2.2 PCR產物的酶切電泳結果與分析 FAdVs(1～7、8a、8b、9～11)Hexon基因894片段的限制性內切酶酶切位點分析發現，Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI、PsyI、BgⅡ組合酶切后有良好的特異性，能有效區分全部12個血清型。

12種血清型FAdVs的PCR片段的Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ組合酶切結果見圖2、圖3和圖4。片段經Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ組合酶切后得到了12種RFLP圖譜，可以區分出12種血清型的FAdVs，酶切結果與軟件分析結果一致。

圖2 FAV-I Hexon基因擴增片段Pf 123Ⅱ和BgⅡ酶切結果
M: DNA Marker DL-2 000 ; 左側1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴增片段的Pf123Ⅱ酶切結果 ; 右側1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVs 的BgⅡ酶切結果

圖3 FAdVs Hexon基因擴增片段Eco130 I和Mlu I酶切結果
M:DNA Marker DL-2 000 ; 左側1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴增片段的Eco130 I酶切結果 ; 右側1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴增片段的MluI酶切結果

圖4 FAdVs Hexon基因擴增片段Psy I酶切結果
M:DNA Marker DL-2 000; 1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴增片段的PsyI酶切結果

2.3 臨床樣本測定 本實驗室2株(RZ株、YTPL株)臨床分離株經Hexon全基因擴增，PCR產物測序確認為FAdVs-4和FAdVs-11。這2個毒株應用上述建立的PCR-RFLP方法進行測定，得到酶切圖譜(圖5、圖6)，經分析比對其圖譜條帶與FAdVs中的FAdVs-4、FAdVs-11型的酶切圖譜相符合。

圖5 RZ株酶切圖譜
M:DNA Marker DL-2 000 ; 1:Pf123Ⅱ; 2:PsyI ;3:Eco130 I ; 4:MluI ; 5:BgⅡ

3 討論

FAdVs共有12個血清型(FAdVs 1～7、8a、8b、9～11)，多數血清型的腺病毒都能引起禽類嚴重的疾病，不同血清型的腺病毒致病性和所引起的癥狀不完全相同[4]。FAdVs還容易與新城疫病毒、雞傳染性貧血病毒、傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒和大腸桿菌等病原混合感染，對家禽養殖業造成了巨大損失[5]。由于不同血清型的FAdVs之間有不同程度的交叉中和作用[6]，所以以血清學方法為基礎的分型方法尚未建立[7]。本試驗建立的方法與序列測定相比較更加簡便、快捷。本試驗中所設計的引物能良好的擴增出FAdVs全部12種血清型，以該引物為基礎的PCR-RFLP有良好的通用性。

圖6 YTPL株酶切圖譜
M:DNA Marker DL-2 000; 1:Pf123Ⅱ; 2:PsyI;3:Eco130 I; 4:MluI; 5:BgⅡ

Zsak等[8]利用BamH I和HindIII對FAdVs進行PCR-RFLP分析，將FAdVs分為5種不同的A～E亞群，研究表明有一定致病性的禽腺病毒毒株之間的基因型具相關性。其中A亞群包含FAdVs-1；B亞群含FAdVs-5；C亞群含FAdVs-4；D亞群包含FAdVs-2、FAdVs-3、FAdVs-9和FAdVs-11；E亞群包含FAdVs-6、FAdVs-7、FAdVs-8a和FAdVs-8b，但其方法不能將全部血清型的FAdVs區分。李海英等[9]根據Hexon全基因的酶切位點，建立了利用限制性內切酶HaeⅡ分型方法，能區分FAdVs；但該方法需要擴增Hexon基因的全長，約2 500 bp，且該方法所得到的酶切圖譜可以區分出FAdVs-3、4、6、8 b、9、10 這6種血清型，而FAdVs-1、2、5、7、8a和11這6種血清型由于酶切條帶太過接近，無法區分，故該方法無法完全區分出FAdVs的 12個血清型。而本試驗中同樣擴增FAdVsHexon基因，但其片段長度較短，易于擴增；且選用限制性內切酶Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ對擴增片段進行酶切分析，酶切圖譜區分度良好，能很好地區分出FAdVs的12個血清型。G.Meulemans等[10]使用與本試驗相同的引物，對FAdVs的Hexon基因進行擴增，并對所得到的PCR產物利用BsiW I、Sty1、MluI、AspI、ScaI和BgⅡ這6種限制性內切酶進行酶切，所得到的酶切圖譜可以將12個血清型的FAdVs區分。與該報道相比，本試驗只需要Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI和BgⅡ這5種限制性內切酶即可完成酶切，故更具有簡便性。

為簡化操作，本試驗采用統一溫度、統一反應時間進行限制性內切酶酶切，且可得到良好的酶切效果，故該方法較為簡便。建立的PCR-RFLP方法對臨床分離株進行酶切分析，其鑒定的血清型結果與Hexon基因的測序結果相一致，表明該方法具有準確性。

故本試驗基于Hexon基因建立的FAdVs PCR-RFLP分型方法，具有準確性、簡便性和良好的區分性，可用于臨床FAdVs的分型診斷。