海蘭褐雞腸道菌群多樣性分析

王海花 ， 張曉峰 ， 祁畫麗 ， 包文奇

(河南牧業經濟學院動物醫學院 鄭州市獸醫生物技術重點實驗室 , 河南 鄭州 450046)

腸道菌群被譽為機體自身的“黑匣子”,是腸道重要的的組成部分,與宿主自身營養物質的消化、代謝以及免疫功能等方面密切相連[1-2]。腸道菌群與宿主之間的這種動態平衡，對動物機體生命活動的正常運轉具有十分重要的意義。一旦這種平衡被打破(如疾病等)，條件性的腸道致病菌便會趁虛而入，動物就有可能產生一系列胃腸道疾病。研究表明，不只是胃腸道疾病，許多疾病都與腸道微生態失調有關系[3-4]。隨著養禽行業迅速發展，腸道菌群失調導致家禽疾病越來越嚴重，因此，關注家禽腸道健康，研究其腸道菌群結構及變化規律有助于調節腸道菌群平衡[5]。本試驗采用不同培養基對海蘭褐雞腸道菌群進行分離培養和16S rDNA測序，并進行分類學和系統發育研究，將為開發更有針對性的微生態制劑產品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 10周齡海蘭褐雞來源于河南牧業經濟學院動物醫院。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集及處理 選取10周齡海蘭褐雞，分為健康雞、非健康和服用過微生態制劑(主要益生菌為枯草芽孢桿菌，糞腸球菌，屎腸球菌)3組，每組選20只，選取的腸段為十二指腸，空腸、盲腸，各腸斷取約10 cm長度，稱其重量，剪碎，分別放入盛有100 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，用恒溫培養搖床搖20 min(120 r/min)[6-7]。

1.2.2 細菌基因組DNA提取 挑取單菌落到5 mL盛有LB和MRS液體培養基的PA瓶中，30 ℃活化3-4 h，培養液稍渾濁，取1 mL加入1.5 mL滅菌離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，再加1 mL STE懸浮菌體，12 000 r/min離心1 min，棄上清。向收集的菌體中加入100 μL TE，沸水煮10 min，立即冰浴10 min，離心5 min取上清液即為DNA模板，將基因組DNA放于-20 ℃，保存備用。

1.2.3 目的基因的擴增與測序 細菌16S rDNA 基因序列的擴增采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系(40 μL)：以提取的細菌基因組DNA為模板2 μL，上游引物(27 F)1 μL，下游引物(1 541 R)1 μL，Taq酶20 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃復性1 min，28個循環，72 ℃延伸10 min,擴增產物4 ℃保存，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。觀察1 500 bp目的片段的條帶是否擴增出來。凡是擴增成功的PCR產物都送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 16S rDNA 序列測定及系統發育分析 將測序成功的菌株序列，選取10～1 500 bp序列，輸入到韓國的EzTaxon-e數據庫(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)中的Identify程序，然后對所得的16S rDNA 基因序列進行菌株相似性信息比對，挑選出與其同源性最高的標準菌株序列。然后用Clustal X 軟件將菌株測序出來的基因序列和標準菌株序列進行比對，利用MEGA6軟件，采用鄰接法構建菌株間的系統發育樹，了解菌株的遺傳進化信息。

2 結果與討論

2.1 健康海藍褐雞腸道細菌多樣性及系統進化分析 本試驗從健康海蘭褐雞的不同腸道中共分離到30株細菌，經16S rDNA 基因序列比對后獲得16種不同的細菌，結果如表1。

表1 健康海蘭褐雞腸道細菌16S rDNA序列鑒定結果

由表1可知，從健康雞的腸道中共分離到16種不同細菌，分屬8個不同屬，其中屬于乳酸桿菌屬的有4個，分別為乳酸桿菌、羅伊氏乳酸桿菌、卷曲乳桿菌、唾液乳桿菌，占25%；屬于芽孢桿菌屬的有3個，分別為特基拉芽孢桿菌、Bacillussiamensis、枯草芽孢桿菌，占19%；屬于腸球菌屬的有3個，分別為耐久腸球菌、乳酸腸球菌、糞腸球菌，占19%；屬于大腸埃希菌屬的有2個，分別為阿爾伯蒂埃希桿菌、大腸埃希菌，占13%；屬于不動桿菌屬的有1個，為谷氨酸不動桿菌；屬于葡萄球菌屬的有1個，為葡萄球菌；屬于巨球菌屬的有1個，為Macrococcuscaseolyticus；屬于志賀菌屬的有1個，為Shigellaflexneri，各占6%，由此可見，在健康雞的腸道中乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬為優勢微生物，其中絕大多數為國家農業部公布的益生菌名錄中的益生菌。

采用Clustal X 軟件將分離出來的16株菌株的16S rDNA 基因序列和標準菌株序列進行比對，利用MEGA6軟件，采用鄰接法構建菌株間的系統發育樹，了解菌株的遺傳進化信息，健康海蘭褐雞腸道微生物系統進化結果如圖1。

由圖1可以看出從健康雞的腸道中共分離到16種不同的細菌被聚類成三大分枝，其中腸球菌屬和乳酸桿菌屬聚類為第一分枝，絕大多數芽孢桿菌聚類為第二分枝，而其余的細菌聚類為第三分枝，因此，從細菌種類結構來說，健康海蘭褐雞腸道微生物主要為乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬，它們為健康海蘭褐雞腸道中為優勢菌。

2.2 非健康海蘭褐雞腸道微生物多樣性及系統進化分析 從非健康海蘭褐雞不同腸道中共分離到15株細菌，經16S rDNA 基因序列比對后獲得10種不同的細菌，結果如表2。

圖1 健康海蘭褐雞腸道微生物系統發育進化樹

表2 得病海蘭褐雞腸道細菌16S rDNA序列鑒定結果

由表2可知，非健康海蘭褐雞的腸道中共分離到10種不同細菌，從種屬結構來看，10種不同細菌分為8個不同屬，其中屬于志賀菌屬的有2個，為鮑氏志賀菌、痢疾志賀菌，占20%；屬于克雷伯菌的有2個，分別為肺炎克雷伯菌、Klebsiellaquasipneumoniae，占20%；屬于腸球菌屬的有1個，為糞腸球菌，占10%；屬于腸桿菌屬的有1個，為路德維希腸桿菌，占10%；屬于氣單胞菌屬的有1個，為Aeromonasbestiarum，占10%；屬于埃希菌屬的有1個，為弗氏埃希菌，占10%；屬于乳酸桿菌屬的有1個，為羅伊氏乳酸桿菌，占10%；屬于巨型桿菌屬的有1個，為巨型球菌，占10%；由此可見，在非健康雞腸道中志賀菌屬和克雷菌屬為優勢細菌。

采用Clustal X 軟件將分離出來的10株菌株的16S rDNA 基因序列和標準菌株序列進行比對，利用MEGA6軟件，采用鄰接法構建菌株間的系統發育樹，非健康海蘭褐雞腸道細菌系統進化結果如圖2。

圖2 非健康海蘭褐雞腸道細菌系統發育進化樹

由圖2可以看出，從得病海蘭褐雞的腸道中共分離到10種不同的細菌被聚類成2大分枝，其中第1分枝7株細菌屬于變形桿菌門，占70%，第2分枝3株細菌屬于厚壁菌門，占30%，因此，從細菌種類結構來說，非健康海蘭褐雞腸道細菌主要為變形桿菌門的細菌。

2.3 飼喂微生態制劑的海蘭褐雞腸道細菌多樣性及系統進化分析 從飼喂過混合微生態制劑2周的健康海蘭褐雞的腸道中共分離到19株細菌，經16S rDNA 基因序列比對后獲得14種不同的細菌，結果如表3。

表3 服用過微生態制劑的海蘭褐雞腸道細菌16S rDNA序列鑒定結果

由表3可知，從飼喂過微生態制劑的海蘭褐雞腸道中共分離到14株不同的細菌，從種屬層面來看，14株不同的細菌分屬12個不同的屬，其中屬于腸球菌屬的有3個，分別為糞腸球菌、海氏腸球菌、屎腸球菌，占21%；屬于芽孢桿菌屬的有2個，Bacillussiamensis和賴氨酸芽孢桿菌，占14%；屬于檸檬酸桿菌屬的有1個，為檸檬酸桿菌；屬于氣單胞菌屬的有1個，為氣單胞菌；屬于不動桿菌屬的有1個，為谷氨酸不動桿菌；屬于金黃桿菌屬的有1個，為Chryseobacteriumginsengisoli；屬于葡萄球菌屬的有1個，為葡萄球菌；屬于寡養單胞菌屬的有1個，為Stenotrophomonaspavanii；屬于乳酸桿菌屬的有1個，為唾液乳桿菌；屬于志賀菌屬的有1個，為弗氏志賀菌；屬于克雷伯菌屬的有1個，為肺炎克雷伯菌，各占7%，由此可見，在飼喂微生態制劑的雞的腸道中腸球菌屬和芽孢桿菌為優勢細菌，其中糞腸球菌、屎腸球菌、唾液乳桿菌及芽孢桿菌為益生菌。飼喂過微生態制劑的海蘭褐雞腸道細菌系統發育進化樹如圖3所示。

圖3 飼喂微生態制劑海藍褐雞腸道細菌系統發育進化樹

由圖3可以看出，從飼喂微生態制劑海蘭褐雞的腸道中共分離到14種不同的細菌被聚類成3大分枝，其中第1分枝7株細菌為變形桿菌門，第2分枝5株細菌為厚壁菌門，第3分枝1株細菌為擬桿菌門(Bacteroidetes)，從細菌種群結構來說，飼喂微生態制劑海蘭褐雞腸道細菌種類更多。

3 結論

3.1 從微生物種群結構來看，健康海藍褐雞腸道中共分離到16種不同微生物，分屬厚壁菌門(Firmicutes)和變形桿菌門(Proteobacteria)，其中厚壁菌門占75%，變形桿菌門占25%，厚壁菌門占優勢；從種屬層面來看，優勢微生物為乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬的微生物，分別占25%、19%、19%。非健康海蘭褐雞的腸道中共分離到10種不同微生物，分屬變形桿菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，其中變形桿菌門占70%，厚壁菌門(Firmicutes)占30%，變形菌門占優勢；從種屬層面來看，優勢微生物為志賀菌屬和克雷菌屬，分別占20%、20%。飼喂過微生態制劑的海蘭褐雞腸道中共分離到14株不同的微生物，主要分布在變形桿菌門(Proteobacteria)占57%，厚壁菌門(Firmicutes)占36%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占7%，從種屬層面看，優勢微生物為腸球菌屬和芽孢桿菌，分別占21%和14%。

3.2 糞腸球菌、乳酸桿菌、志賀菌在不同健康狀態的海蘭褐雞腸道中都存在，腸球菌為兼性厭氧菌，屎腸球菌和糞腸球菌都廣泛分布在各個腸段。乳酸桿菌屬于有益菌，是動物健康不可缺少的要素，可以合成各種維生素，參與食物消化。而志賀菌是細菌性痢疾最為常見的病原菌，能夠引起拉稀、腹瀉等癥狀。其中健康狀態和飼喂微生態制劑的海蘭褐雞腸道微生物以腸球菌屬和乳酸桿菌屬為主，而患病的海蘭褐雞的腸道微生物以志賀菌為主，也說明飼喂微生態制劑對調節動物腸道微生態，增強腸道有益微生物數量,提高動物腸道健康有重要意義。