二氯乙酸鈉對氧糖剝奪損傷的BV2細胞的保護作用及其機制研究

趙 輝，章越凡，李鐵軍,3

(1.安徽中醫藥大學藥學院 ，安徽 合肥 230012；2.海軍軍醫大學藥學院藥理學教研室，上海200433；3.上海市浦東新區浦南醫院藥劑科，上海200125)

缺血性卒中是一種常見的神經系統性疾病，是導致死亡的主要原因[1]。膠質細胞是腦內的天然免疫效應細胞，參與一系列神經退行性病變[2]。活化的小膠質細胞釋放促炎因子以及細胞毒性因子(如NO和ROS)，導致神經元損傷[3]。研究表明，小膠質細胞激活誘發的炎癥反應參與了腦卒中的損傷過程[4]。二氯乙酸鈉(DCA)是一種可口服吸收的小分子化合物，臨床上可用于治療線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發作(MELAS)綜合征、先天性乳酸性酸中毒和其他疾病的兒童[5]。最近的研究發現，DCA通過抑制 PDK2和減少冠狀動脈肌內膜增生而起到潛在的血管保護作用[6]，并促進腦缺血后的腦再生[7]。筆者使用 BV2細胞的OGD損傷模型，探討DCA治療是否具有保護作用及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

BV2細胞購自中科院上海細胞庫，培養在含10% FBS的DMEM完全培養基中(37℃，5% CO2)，每48 h更換培養基并傳代。

1.2 藥物與試劑

二氯乙酸鈉(DCA，TCI公司，貨號：D1719)； DMEM完全培養基、DMEM無糖培養基 (Gibco 公司)；凋亡檢測試劑盒、NO試劑盒、ROS試劑盒、蛋白質提取試劑盒(上海碧云天生物技術公司) ；抗體:β-actin， SAPK/JNK， P-SAPK/JNK， I-κB， P-I-κB， stat3， P-stat3， NF-κB， P-NF-κB (CST公司)。

1.3 儀器

細胞培養箱(Thermo 公司)；高速水平離心機 (Eppendorf公司)；缺氧裝置(Billups-Rothenberg 公司)；酶標儀(Thermo 公司)；流式細胞儀 (BD Biosciences公司); Western blot 圖像掃描儀(Odyssey公司)。

2 方法

2.1 OGD 模型的建立

參考文獻[8]建立體外模擬腦缺血模型，即OGD模型，并根據本實驗目的稍作修改。細胞接種在細胞培養板中。細胞貼壁后，對照組更換為不含血清的DMEM，OGD組用無糖 DMEM培養基，DCA給藥組更換為加有 DCA的無糖 DMEM培養基，于培養箱中適應1 h，然后置于缺氧裝置中，通入混合氣(95%N2、5% CO2)密閉后，置于培養箱中，1～4 h后取出細胞，做后續處理。

2.2 CCK8法測定細胞活力

將BV2細胞以1.2×105個/ml的密度接種于96孔板中，按照“2.1”項下操作方法，在 OGD之前將給藥組更換為加入不同濃度的二氯乙酸鈉( 1、10、100、400、800 μmol/L)適應性培養1 h，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h后，采用 CCK-8法檢測細胞活力， 用酶標儀測定450 nm處上述不同濃度組的吸光度值(A)。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

以1.0×106個/ml的密度將 BV2細胞接種于6孔板中，分為對照組、OGD組和給藥組，細胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養基，適應性培養1 h后，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h，之后分別收集各組細胞，使用凋亡試劑盒對細胞進行處理，流式細胞術檢測細胞凋亡。

2.4 流式細胞術檢測細胞內ROS和NO的表達

以1.0×106個/ml的密度將 BV2細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養基，適應性培養1 h后，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h，之后分別收集各組細胞，按照相應的ROS和NO檢測試劑盒說明書對細胞進行前處理，流式細胞術檢測ROS和NO含量。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達

以1.0×106個/ ml的密度將 BV2細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養基，然后 OGD 4 h， 結束后分別收集各組細胞，置于 預冷的RIPA裂解液中裂解30 min，離心，取上清液。BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白，轉移至硝酸纖維素膜上，將硝酸纖維素膜用含有5%脫脂奶粉的 Tris緩沖液封閉2 h， 4 ℃環境下一抗孵育過夜，棄去一抗，漂洗3次(5 min/次)，室溫下與二抗孵育1 h后洗滌膜。使用Western blot 圖像掃描儀進行掃描統計。

2.6 統計分析

使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。數據以(均數±標準差)表示。t檢驗用于組間比較，P<0.05時表示有統計學意義。

3 結果

3.1 DCA對OGD誘導的 BV2 細胞損傷的保護作用

OGD 1～4 h后，細胞生存率顯著降低，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，以 OGD 4 h為最佳時間(圖1A)。DCA濃度為400 μmol/L可顯著提高 OGD 4 h后的細胞活力(P<0.01)，因此選擇 OGD 4 h，給藥濃度400 μmol/ L作為后續試驗條件(圖1B)。

圖1 DCA對OGD誘導BV2細胞損傷的影響 A.不同的OGD時間；B.不同的DCA濃度(μmol/L)*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較；##P<0.01,與OGD組比較

3.2 DCA降低OGD誘導的 BV2 細胞凋亡

為了考察DCA對 OGD 損傷的BV2細胞凋亡的影響，本研究采用流式細胞術檢測細胞凋亡。結果顯示(圖2)，與對照組相比， OGD誘導細胞的凋亡率增加，由對照組(2.62±0.22)%上升到(8.55±0.37)%(P<0.01)，而DCA可顯著減少細胞凋亡，凋亡率降至(3.95±0.16)% (P<0.01)。

3.3 DCA降低OGD誘導的BV2細胞中ROS和NO的含量

與對照組相比， OGD提高了BV2細胞中ROS和NO的含量 (P<0.01); 而DCA可顯著降低BV2細胞內ROS(P<0.01)和NO(P<0.05)的含量(圖3)。

3.4 DCA 對 NF-κB/STAT3信號通路的調節作用

NF-KB信號通路廣泛參與凋亡、炎癥反應，因此本研究檢測了 DCA對該信號通路的影響。結果如圖4A和圖4B所示， OGD損傷后 P-NF-κB、 P-JNK及 P-I-κB的表達水平均顯著升高(P<0.01)； DCA可顯著下調 OGD誘導的P-NF-κB，P-JNK(P<0.05)及 P-I-κB蛋白的升高(P<0.01)。而 STAT3在腦卒中血管生成方面起到重要作用， OGD后 P-STAT3表達顯著上調(P<0.01)，而 DCA治療組 P-STAT3表達顯著降低(P<0.05)。

圖2 DCA對OGD誘導的 BV2 細胞凋亡率的影響 A.流式細胞術檢測細胞凋亡情況；B.細胞凋亡比例 **P<0.01,與對照組比較；##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

圖3 DCA對OGD誘導的 BV2 細胞內ROS和NO含量的影響 A.流式細胞術檢測細胞內ROS含量；B.ROS含量統計圖；C.流式細胞術檢測細胞內NO含量；D.NO含量統計圖**P<0.01,與對照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

4 討論

卒中是由血管阻塞或出血引起的腦血液循環障礙并誘發腦神經系統的損傷，致死率較高，其病理機制復雜， 目前仍缺乏有效的治療方法，而炎癥反應已被證實為卒中誘發損傷中一個關鍵影響因素。小膠質細胞的激活是誘發卒中炎癥反應的主要原因之一[9]，激活的小膠質細胞在形態及功能上會發生明顯改變，并在炎癥部位產生大量的神經毒素和促炎癥介質， 從而導致神經元損傷，并且會釋放促炎因子和細胞毒性因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、NO和ROS[4]。因此，降低小膠質細胞的激活以及抑制其細胞毒性因子的釋放對神經元的保護具有重要作用。

圖4 DCA 對OGD誘導下BV2細胞 NF-κB/STAT3通路的影響 A.Western blotting檢測JNK、NF-κB、I-κB、STAT3及其磷酸化蛋白的表達水平；B.p-JNK/JNK比值；p-NF-κB/NF-κB比值；p-I-κB/I-κB比值；p-STAT3/STAT3比值**P<0.01,與對照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

最新研究表明， DCA在血管保護和促進血管內皮修復中起著重要作用[6]，可以改善動脈粥樣硬化患者的血管鈣化[10]。然而，DCA對小膠質細胞激活引起的炎癥反應的作用尚無研究報道。 本實驗研究了DCA對OGD誘導的BV2小膠質細胞凋亡和炎癥反應的抑制作用，并初步探討其可能的機制。首先建立 OGD損傷BV2細胞模型，同時加入不同濃度的DCA進行處理。結果發現，DCA可劑量依賴性地抑制 OGD介導的BV2細胞損傷，并且當 DCA濃度為400 μmol/L時抑制作用最強。于是，筆者選擇400 μmol/L給藥劑量進行機制探討。

本研究結果表明，經過OGD損傷，BV2細胞凋亡明顯增加并且細胞內 ROS和 NO水平顯著升高， 而 DCA可顯著抑制細胞凋亡并下調細胞內ROS、 NO的水平， 提示DCA可能通過抑制BV2細胞激活后ROS和NO的水平發揮神經保護活性。為進一步探討 DCA是否通過抗炎作用發揮對小膠質細胞的保護作用，筆者對 JNK、 I-κB和 NF-κB的蛋白表達， I-κB磷酸化水平以及 NF-κB磷酸化水平進行檢測。NF-κB作為促炎因子基因表達的最主要調節者之一[11]，與腦缺血再灌注損傷中神經炎癥的發生及小膠質細胞激活密切相關[12]。 I-κB是 NF-κB信號通路的重要組成，正常情況下，I-κB和NF-κB形成復合體存在于胞質中。當受到胞外信息刺激時， I-κB發生磷酸化并被泛素-蛋白酶體系統降解，導致 NF-κB p65核結合位點暴露并使之發生核轉位， NF-κB p65入核后與相關免疫基因結合進而促進這些基因轉錄。本研究結果顯示，OGD誘導的 BV2 細胞激活伴隨JNK、I-κB 、NF-κB磷酸化水平的增加； 而DCA處理可顯著抑制上述改變。結合 DCA對 OGD所致BV2細胞激活后 ROS、 NO表達的降低，表明DCA可能通過抑制 JNK/I-κB/ NF-κB信號通路的激活，進而抑制 OGD誘導的BV2細胞炎癥反應，最終發揮神經保護作用。

本研究結果表明，DCA能夠顯著抑制 OGD誘導的BV2細胞凋亡并且可以減少細胞內ROS和NO的水平，并通過調控NF-κB/STAT3信號通路產生抗炎及神經保護作用。DCA可能在腦缺血中對小膠質細胞引起的損傷具有保護作用。進一步的研究需要在腦缺血動物模型上更深入地解釋DCA對腦缺血的影響及其作用機制，為DCA在臨床用于缺血性腦卒中的治療提供藥理學理論基礎。