正交試驗和人工神經網絡模型優化通痹凝膠貼劑提取工藝

馬建春，李勇

(1.廣東藥科大學附屬第一醫院藥學部，廣東 廣州 510080；2.廣東藥科大學臨床藥學系，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學藥物研究所，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

中藥新藥通痹凝膠貼劑由秦艽、 制草烏等中藥組成，具有祛風、 除濕、 散寒的功效，主治風、濕夾雜之寒痹癥。秦艽中所含的環烯醚萜苷類化合物龍膽苦苷具有明顯的鎮痛抗炎作用[1]。制草烏所含的烏頭類生物堿具有鎮痛、抗炎等藥理作用[2]。由于中藥復方為多成分復雜體系，單一指標變化趨勢難以體現復方整體質量，因此本實驗以龍膽苦苷含量、烏頭總生物堿含量、總固體得率等為評價指標。為體現各指標在提取結果分析中的作用，分析3個指標的權重系數，利用反向傳播人工神經網絡(BP-ANN)模型對正交試驗得到的提取工藝進行仿真優化，最終確定最佳提取工藝。本研究將層次分析(AHP)法、CRITIC法、正交試驗、BP-ANN等方法聯合應用，為中藥復方提取工藝優化提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV-2450紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)；CPA225D型電子分析天平(北京Sartorius公司)。

1.2 藥物及試劑 秦艽、制草烏等藥材購自廣州致信藥業有限公司，符合《中國藥典》2015年版有關規定；對照品龍膽苦苷(批號：110770-201013)、烏頭堿(批號：110720-201111)均購自中國食品藥品檢定研究院(供含量測定用)；液相用甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；液相用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品溶液制備 按通痹貼劑處方藥物組成及比例，稱取秦艽、制草烏等藥材，按照正交試驗各條件進行提取，濾液濾過，定容至500 mL，作為樣品溶液。

2.2 總固體測定 精密量取“2.1”項下樣品溶液，置干燥至恒重蒸發皿中，在水浴上蒸干后，置烘箱中105 ℃干燥5 h，后移至干燥器中，冷卻30 min，再于105 ℃干燥1 h，冷卻，稱重，直至恒重，計算總固體得率。

總固體得率(%)=干燥后固體重量/藥材重量×100%。

2.3 總生物堿含量測定[3]對照品溶液的制備:精密稱取烏頭堿對照品10.03 mg至量瓶中，加0.01 mol·L-1鹽酸溶解并定容至10 mL，得烏頭堿對照品溶液。

測定:取對照品溶液及樣品溶液各1.0 mL，分別置于分液漏斗中，加乙酸鈉緩沖液5.0 mL與溴甲酚綠指示劑2.0 mL，后加超純水至10.0 mL，混合均勻。再精密加入三氯甲烷10.0 mL，充分振搖3 min，靜置10 min后，取下層三氯甲烷液，濾過，棄去初濾液，收集續濾液至已放入0.5 g無水硫酸鈉的試管中，密塞，靜置30 min，于紫外-可見分光光度計415 nm波長處測定吸光度，計算烏頭總生物堿含量。

2.4 龍膽苦苷含量測定[4]對照品溶液的制備:精密稱取龍膽苦苷對照品14.02 mg至量瓶中，加甲醇溶解并定容至20 mL，得龍膽苦苷對照品溶液。

供試品溶液制備:精密吸取“2.1”項下樣品溶液1 mL，加甲醇稀釋并定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

陰性供試品溶液制備:按處方藥物比例，按照“2.1”項下制備方法，制備不含秦艽藥材的陰性樣品溶液。精密吸取陰性樣品溶液，加甲醇稀釋并定容至20 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，得陰性供試品溶液。

色譜條件:色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%醋酸溶液(9∶91，V/V)；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；理論塔板數以龍膽苦苷峰計算應不低于3 000。結果顯示供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時間處，具有相應的色譜峰，且陰性無干擾，色譜圖見圖1。

A.龍膽苦苷對照品；B.供試品；C.陰性供試品圖1 龍膽苦苷HPLC色譜圖

2.5 各指標權重分析 參考文獻[5-6]，采用AHP法結合CRITIC法對龍膽苦苷、烏頭總生物堿、總固體得率等3個指標建立綜合權重。

AHP權重系數的確定：根據通痹凝膠貼劑中藥物君臣佐使配伍規律，烏頭總生物堿、龍膽苦苷及藥效作用強弱，將烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率這3個指標分成3個層次進行量化，按照烏頭總生物堿>龍膽苦苷>出膏率的順序進行排序，構建不同指標組合的比較優先矩陣，并計算各項指標的相對評分。經過計算，烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率的AHP法權重系數分別為0.389、0.354、0.257。一致性比較因子CI=0.04，一致性比率CR=0.06，均<0.1，表明指標優先比較判斷矩陣具有一致性。

CRITIC法權重系數的確定：將正交試驗各指標9組數據經線性插值處理[指標成分=(該實驗指標成分含量-最低含量)/(最高含量-最低含量)×100]，消除單位量綱后，計算烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率各指標對比強度(si)、沖突性(δi)、綜合權重(ci)與權重(ωi)。經CRITIC法后得到烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率的權重系數分別為0.425、0.335、0.240。

AHP-CRITIC混合加權法確定權重：AHP法得到了以主觀信息為基礎的權重系數，CRITIC法求得相應指標的客觀權重系數，將兩種系數綜合，得到3個指標成分的綜合權重。綜合權重公式為ω綜ij=ωAHP-ijωCRITIC-ij/∑ωAHP-ijωCRITIC- ij。經過計算，烏頭總生物堿、龍膽苦苷、總固體得率的綜合權重分別為0.526、0.344、0.130，即綜合評分=(烏頭總生物堿測得含量/烏頭總生物堿最高含量)×0.526×100+(龍膽苦苷含量/龍膽苦苷最高含量)×0.344×100+(總固體得率/總固體最高得率)×0.130×100。

2.6 正交試驗設計及結果 根據文獻報道[4，7]及預實驗結果，本研究采用L9(34)正交試驗設計通痹凝膠貼劑提取工藝，以烏頭總生物堿含量、龍膽苦苷含量、總固體得率為指標，對影響提取效率的4個因素乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取次數(C)及提取時間(D)等進行正交試驗，試驗設計及結果見表1。

表1 通痹凝膠貼劑正交試驗結果

表2 正交試驗方差分析

注：*F0.05(2,2)=19.00

由表1正交試驗結果可知，影響通痹凝膠貼劑提取工藝的因素由大到小依次為：C>B>A>D，表2方差分析結果表明提取次數在各水平間具有顯著性差異，是影響通痹凝膠貼劑提取的主要因素。最佳工藝組合為A1B3C2D3，即藥材加12倍量60%乙醇提取2次，每次2 h。

2.7 BP神經網絡建模與應用[8-10]

2.7.1 BP-ANN模型構建 采用Matlab R2014a數學軟件(美國MathWorks公司)構建 N為隱含層的4-N-1型BP神經網絡模型，以乙醇濃度、乙醇用量、提取次數、提取時間這4個影響因素數據為輸入層，以綜合評分為輸出層，構建提取工藝仿真優化模型，神經網絡圖見圖2。

圖2 BP神經網絡運行模型

2.7.2 BP神經網絡的運行

2.7.2.1 神經網絡模型測試 將表1的9組數據導入BP神經網絡模型，其中隨機抽取7組數據用于模型訓練，剩余2組數據用于模型測試。通過對不同神經元數進行訓練，得知當隱含層節點數為10時，其中訓練函數為trainlm，最大訓練迭代次數為500，隱含層神經元的傳遞函數為tansig，輸出層神經元的傳遞函數為 purelin，其他各項參數為默認值時，2組預測數據的輸出值與實際值相對誤差小于1.5%，表示該神經網絡模型訓練與預測精度較好，滿足試驗要求。

2.7.2.2 神經網絡模型最佳工藝的仿真優化 對正交試驗中乙醇濃度、乙醇用量、提取次數、提取時間4個因素的3個水平進行任意組合，可得到64種不同組合。將這64種組合作為輸入值，用“2.7.2.1”項下構建的神經網絡模型進行仿真優化。通過對輸出層的綜合評分結果進行篩選，最終確定通痹凝膠貼劑的最優提取工藝為：藥材加10.8倍量67%提取2次，每次1.7 h。

2.8 驗證試驗 分別按照正交試驗及BP神經網絡優化得到的提取工藝進行提取工藝驗證，平行3次。應用正交試驗得到提取工藝的綜合評分平均值為94.74，按照BP神經網絡優化得到的提取工藝條件的綜合評分平均值為95.03，兩種提取工藝綜合評分接近，但BP神經網絡優化的提取工藝具有乙醇用量少、提取時間短、能耗低的優點。

3 討論

3.1 目前中藥制劑一般采用多指標優選提取工藝，但多數研究對各指標的權重賦值采用主觀法，不能真實反映各指標對提取效率的貢獻。AHP法結合CRITIC法確定指標權重系數是比較可靠的方法。其中AHP法將不同指標之中任意兩個指標間的優先信息進行了量化，在遵循中藥配伍原則的基礎上得到了偏向于主觀評價的權重系數，初步揭示了各指標的權重系數。CRITIC法以評價指標間的對比強度和沖突性為基礎，能夠反映各指標的客觀權重[5-6]。為保證各指標的權重準確性，將主觀指標與客觀指標相結合，計算綜合權重，工藝評價結果會更加客觀、真實，優選的工藝更適于工業化生產。

3.2 正交試驗作為中藥提取優選最常用的方法，是用部分試驗代替全面試驗，不能對各因素變化情況進行全面分析，當試驗因素和水平較多的情況下，試驗次數會成倍增加。利用人工神經網絡技術的預測與推斷能力，通過建立某種簡單模型，運用自組織和實時學習的優點，模擬中藥提取、純化、成型等工藝中各種因素的變化趨勢，分析數據間效應、交互作用，獲得不同因素的最優組合，節約研究時間與成本。本研究將正交試驗與人工神經網絡技術結合，仿真優化提取工藝條件，得到的工藝條件具有提取效率高、能耗低的優點。