雌激素水平對(duì)腎血管性高血壓大鼠腎功能及氧化應(yīng)激的影響

劉 丹，阿瓦古麗·達(dá)吾提，阿迪拉·迪里夏提，阿布來提·阿布力孜，阿地力江·薩吾提，鄔利婭·伊明

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，烏魯木齊 830011)

腎血管性高血壓是最常見的繼發(fā)性高血壓，約占高血壓患者的5%～10%，主要是由單側(cè)或雙側(cè)腎動(dòng)脈狹窄引起的腎血流量減少所致。該疾病的動(dòng)物模型是兩腎一夾腎型高血壓大鼠。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的過度激活是腎血管性高血壓形成的主要因素[1-3]。與同齡男性相比，女性心血管疾病和腎臟疾病的發(fā)病率和患病率較低，從慢性腎病到終末期腎衰竭的進(jìn)展較慢。絕經(jīng)后的女性隨著年齡的增長和雌激素水平的降低，性別優(yōu)勢(shì)變小或消失，說明雌激素水平的變化可能影響心血管系統(tǒng)疾病和腎臟疾病的發(fā)生[4-6]。

本研究選用10周齡雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠制備腎血管性高血壓模型，切除雙側(cè)卵巢造成雌激素水平低下，再補(bǔ)充雌激素治療。研究雌激素水平對(duì)腎血管性高血壓大鼠腎功能及氧化應(yīng)激的影響。

1 儀器與材料

1.1儀器 全波長酶標(biāo)儀(中國賽默飛世爾科技有限公司)；超高速低溫離心機(jī)(德國Sartorius公司)；PowerLab血壓檢測(cè)分析系統(tǒng)(上海埃德儀器國際貿(mào)易有限公司)；AL104電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 戊巴比妥鈉(批號(hào)921019,上海行知化工廠)；肝素鈉(批號(hào)H8060，北京索萊寶科技有限公司)；注射用青霉素鈉[批號(hào)017140504，中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司]；β-雌二醇(批號(hào)082009，北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；蛋白定量(考馬斯亮藍(lán))試劑盒(批號(hào)20180117)，丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20180124)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)20180127)，均購自南京建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物 80只10周齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量為200±20 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，SD大鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、自由飲水。所有實(shí)驗(yàn)程序均獲得新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(新)2016-0003。

2 方法

2.1腎血管性高血壓模型的制備 取雌性SD大鼠80只。隨機(jī)分為雌性假手術(shù)組、雌性手術(shù)組、雌性手術(shù)去勢(shì)組和雌激素治療組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照文獻(xiàn)[7]所述，腹腔注射40 mg·mL-1的戊巴比妥鈉麻醉，分離右側(cè)腎動(dòng)脈并套以內(nèi)徑為0.25 mm的U型銀夾。完成一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)，縫合切口完成腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)。雌性假手術(shù)組所有操作同雌性手術(shù)組，分離腎動(dòng)脈后不套U型銀夾，每只大鼠后肢肌肉注射青霉素鈉8萬單位預(yù)防感染。將術(shù)后大鼠進(jìn)行保溫，清醒后每籠放5只，置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2雙側(cè)卵巢切除手術(shù) 40只雌性SD大鼠完成腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)后，按照文獻(xiàn)[8]所述，繼續(xù)分離位于腰椎兩側(cè)腎臟下方的卵巢，結(jié)扎其血管及脂肪組織并切除。使腹腔臟器復(fù)位后，分層縫合覆膜組織及皮膚并對(duì)切口消毒，后肢肌肉注射青霉素鈉8萬單位預(yù)防感染。

2.3血壓的測(cè)定 喂養(yǎng)32周后，給大鼠腹腔注射40 mg·mL-1的戊巴比妥鈉麻醉，準(zhǔn)確稱定體質(zhì)量。頸部和腹部剃毛，固定在手術(shù)板上，分離右側(cè)頸動(dòng)脈，行頸動(dòng)脈插管，與PowerLab血壓檢測(cè)系統(tǒng)連接，連續(xù)測(cè)定15 min，記錄收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)。高血壓的成模標(biāo)準(zhǔn)為SBP>140 mmHg；雌性假手術(shù)者以SBP<140 mmHg為篩選標(biāo)準(zhǔn)，符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠入選。

2.4大鼠血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平的測(cè)定 將入選的大鼠頸動(dòng)脈插管取血3 mL，在4 ℃條件下以3 000 r·min-1離心10 min，取血清，-80 ℃凍存，待測(cè)。用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定Scr和BUN水平。

2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 取腎臟組織，用生理鹽水制備10 %的組織勻漿液。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織蛋白；WST-1法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)水平；TBA法測(cè)定丙二醛(MDA)水平,上述指標(biāo)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

3 結(jié)果

3.1雌激素水平對(duì)各組大鼠血壓的影響 大鼠手術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)32周，用40 mg·mL-1的戊巴比妥鈉麻醉行頸動(dòng)脈插管測(cè)定各組大鼠的血壓，雌性手術(shù)組SBP和DBP顯著高于雌性假手術(shù)組(P<0.01)，說明高血壓模型造模成功。雌性手術(shù)去勢(shì)組和雌激素治療組SBP高于雌性假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與雌性假手術(shù)組比較，雌性手術(shù)組、雌性手術(shù)去勢(shì)組和雌激素治療組DBP顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；雌性手術(shù)去勢(shì)組、雌性手術(shù)組和雌激素治療組腎臟重量指數(shù)(RKW/BW)高于雌性假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 雌激素水平對(duì)各組大鼠血壓的影響

項(xiàng)目雌性假手術(shù)組雌性手術(shù)組雌性手術(shù)去勢(shì)組雌激素治療組SBP/mmHg131.6±7.57190.5±23.03??176.9±15.22?186.9±12.75??DBP/mmHg101.1±10.41152.5±14.94??146.1±10.82??153.2±11.99??BW/g360.8±26.30338.4±32.41393.5±49.00△305.9±35.95??RKW/BW/mg·g-12.59±1.163.96±1.17??3.83±0.08?4.40±1.19??

注：與雌性假手術(shù)組比較*P<0.05,**P<0.01;與雌性手術(shù)組比較△P<0.05。

3.2雌激素水平對(duì)各組大鼠腎功能的影響 雌性手術(shù)組BUN水平高于雌性假手術(shù)組(P<0.05)，說明高血壓的形成加重了腎臟的損傷。雌激素治療組BUN水平顯著高于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組(P<0.01)。雌激素治療組Scr水平高于雌性假手術(shù)組、雌性手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雌性手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組BUN和Scr水平差異無明顯變化，結(jié)果見表2。

表2 雌激素水平對(duì)各組大鼠腎功能的影響

項(xiàng)目雌性假手術(shù)組雌性手術(shù)組雌性手術(shù)去勢(shì)組雌激素治療組Scr水平/μmol·L-159.98±2.5669.12±6.4867.67±7.3087.6±14.08??△△#BUN水平/μmol·L-17.22±1.40 12.2±3.41?10.26±1.7916.2±3.74??##

注：與雌性假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與雌性手術(shù)組比較△△P<0.01；與雌性手術(shù)去勢(shì)組比較#P<0.05，##P<0.01。

3.3雌激素水平對(duì)各組大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平的影響 與雌性假手術(shù)組比較，雌性手術(shù)組SOD水平明顯降低(P<0.05)，說明高血壓的形成增加了腎臟的氧化應(yīng)激水平；雌激素治療組SOD水平低于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組(P<0.01,P<0.05)，雌性手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組SOD水平差異無明顯變化。雌激素治療組MDA水平高于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組(P<0.01，P<0.05)，其余各組無明顯變化，結(jié)果見表3。

表3 雌激素水平對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

項(xiàng)目SOD水平/U·mg-1MDA水平/nmol·mg-1雌性假手術(shù)組54.86±17.100.28±0.09雌性手術(shù)組36.31±3.21?0.47±0.10雌性手術(shù)去勢(shì)組44.11±5.880.35±0.13雌激素治療組27.69±2.62??#0.58±0.11??#

注：與雌性假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與雌性手術(shù)去勢(shì)組比較#P<0.05。

4 討論

心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有明顯的性別差異。絕經(jīng)前婦女心血管疾病的發(fā)生率明顯低于同齡男性，而絕經(jīng)后婦女心血管疾病的發(fā)生率明顯高于同齡男性[9]。雌激素水平的下降，是絕經(jīng)后婦女最主要的生理變化。激素替代治療長期以來在預(yù)防絕經(jīng)后婦女心血管疾病中起重要作用，能使絕經(jīng)后婦女的心血管疾病發(fā)生率減少35%～50%[10]。WHI(Women Health Initiative)的研究結(jié)果認(rèn)為：雌激素替代會(huì)增加心臟病和中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)，建議停止使用[11]。WHI的單純雌激素替代研究因缺乏心血管的保護(hù)作用而終止[12-14]。雌激素是否對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用存在爭議及許多尚不明了的問題。

RAS激活促使血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的生成增加，AngⅡ在高血壓的形成過程中發(fā)揮著重要作用[15]。研究顯示，慢性腎臟疾病的進(jìn)展存在的性別差異可能與腎臟RAS表達(dá)的性別差異以及雌激素對(duì)腎臟 RAS的調(diào)控有關(guān)。通過切除卵巢和雌激素替代的實(shí)驗(yàn)研究，顯示雌激素可上調(diào)腎臟AngⅡ2型受體(AT2R)mRNA及其蛋白表達(dá)水平[16]。本研究結(jié)果顯示，采用兩腎一夾的方式建立腎型高血壓模型，通過檢測(cè)血壓水平可知，雌性手術(shù)組大鼠的SBP水平顯著高于雌性假手術(shù)組。說明兩腎一夾的手術(shù)操作能夠通過一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄來引起血壓升高。

腎臟既是血壓調(diào)節(jié)的重要器官，又是高血壓損害的靶器官之一[17]。高血壓腎損害是原發(fā)性高血壓常見而嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是終末期腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌性手術(shù)組BUN水平明顯高于雌性假手術(shù)組，說明高血壓的形成加重了腎臟損傷程度；雌激素治療組Scr和BUN水平顯著高于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組，說明腎型高血壓大鼠去勢(shì)后補(bǔ)充雌激素治療加重了腎功能受損程度。

活性氧的過度生成造成氧化應(yīng)激和機(jī)體內(nèi)抗氧化能力降低與高血壓的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[19-21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與雌性假手術(shù)組相比，雌性手術(shù)組腎臟組織中的SOD活性明顯降低，雌激素治療組腎臟組織中的SOD活性明顯低于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組；雌激素治療組腎臟組織MDA水平明顯高于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組，提示雌激素治療組腎血管性高血壓大鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激損傷明顯高于雌性假手術(shù)組和雌性手術(shù)去勢(shì)組。

綜上所述，雌性腎血管性高血壓大鼠切除雙側(cè)卵巢致雌激素水平低下后，補(bǔ)充雌激素治療可加重腎血管性高血壓大鼠腎功能損傷程度和氧化應(yīng)激水平。