百合地黃湯不同萃取部位的鎮(zhèn)靜催眠活性研究

鄭竹宏，趙仁云，丁玉婷，張 娜，孫玉杰，李劍豪，楊雨薇，孫毅坤

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

由于黑腹果蠅在遺傳、節(jié)律等方面與哺乳動物具有很多相同的特征[11-13]，在睡眠的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制和相關(guān)基因研究方面受到人們的高度關(guān)注[14]；因此，本實驗以果蠅為模式生物，借助新型果蠅活動監(jiān)測裝置，以果蠅的睡眠時間為指標(biāo)，篩選得到百合地黃湯提取物鎮(zhèn)靜催眠的有效部位，并基于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平對各有效部位的鎮(zhèn)靜催眠作用進(jìn)行研究，為明確百合地黃湯鎮(zhèn)靜催眠作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 新型果蠅活動監(jiān)測裝置，實驗室自制；DZ-IAII型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；RXZ-280B型智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠)；萬分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；GTR10-2型高速冷凍離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司)；Alliance 2695型高效液相色譜儀，ECD 2465型電化學(xué)檢測器[沃特世科技(上海)有限公司]。

1.2試藥 百合(產(chǎn)地江蘇，批號160926003)、生地黃(產(chǎn)地河南，批號160503005)，均購于北京康源祥瑞醫(yī)藥科技有限公司，并由北京市藥品檢驗所常增榮主任藥師鑒定；戊巴比妥鈉(批號WS20060401)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多巴胺(DA，批號100070-201507)，購于中國食品藥品檢定研究院；5-羥色胺(5-HT，批號BO1022DA14)，高香草酸(HVA，批號S07J6G1)，5-羥吲哚乙酸(5-HIAA，批號K10A8B33603)，均購于上海源葉生物科技有限公司；玉米粉、黃豆粉(食品級)、瓊脂粉、酵母粉、麥芽糖和丙酸，均購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1百合地黃湯不同部位萃取物的制備 按照百合∶生地黃=2∶1的比例稱取適量，用12倍量體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液浸泡60 min，回流提取90 min，提取2次，合并提取液并減壓濃縮至無醇味。用熱水分散后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及水飽和正丁醇萃取分離，將各萃取部位濃縮，50 ℃真空干燥，得百合地黃湯石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和水飽和正丁醇部位的萃取物粉末，密封，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 分別取玉米粉、黃豆粉、瓊脂粉和麥芽糖27，18，2和50 g，加入800 mL蒸餾水中，煮沸，待溫度降至室溫后，加入丙酸5 mL和酵母粉13 g，混勻，倒入滅菌后的果蠅培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基厚度為 2 cm，冷卻，待培養(yǎng)基凝固，備用。

2.3含藥培養(yǎng)基的制備 在2.2項下基礎(chǔ)培養(yǎng)基的原料中加入一定量的百合地黃湯提取物、石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和水飽和正丁醇萃取物，按照2.2項下培養(yǎng)基的配制方法，分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%，2.50%和5.00%的含藥培養(yǎng)基，并配制5.00%的陽性藥培養(yǎng)基，將含藥培養(yǎng)基倒入一次性無菌培養(yǎng)皿中，厚度為2 mm，冷卻凝固，備用。將監(jiān)測管一端插入培養(yǎng)基后拔出，并蘸取融化好的蠟液進(jìn)行蠟封，待蠟液冷卻凝固后，另一端用棉球封住。

2.4果蠅睡眠-覺醒活動監(jiān)測 以野生型 Canton S 品系野生型黑腹果蠅作為觀察對象，收集12 h內(nèi)羽化未交配的雌性處女果蠅，用乙醚麻醉，將果蠅置于含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中飼養(yǎng)，分為空白組、模型組和給藥組，每組32只。于第4天早7點給藥，將空白組和模型組果蠅移入含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的監(jiān)測管中[15-17]，夜間采用光照刺激復(fù)制失眠模型。監(jiān)測前適應(yīng)環(huán)境 24 h，從第7天上午7點至次日上午7點，采用新型果蠅活動監(jiān)測裝置，以果蠅睡眠時間為評價指標(biāo)，對每只果蠅的睡眠活動進(jìn)行24 h連續(xù)監(jiān)測。數(shù)據(jù)采集軟件自動記錄果蠅即時活動距離，以1 min為單位記錄每幀的活動情況。

2.5HPLC-ECD法測定果蠅腦部單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

2.5.1樣本采集 收集12 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，用乙醚麻醉，將果蠅置于含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中飼養(yǎng)，分為空白組、模型組和給藥組，每組80只。于第4天早7點給藥，將空白組和模型組果蠅移入含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，夜間采用光照刺激復(fù)制失眠模型，于第8天早7點收集果蠅腦部。

2.5.2蛋白沉淀劑的制備 分別取乙二胺四乙酸二鈉和亞硫酸鈉0.011 3和0.006 2 g，高氯酸858 μL，置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得蛋白沉淀劑。4 ℃避光保存，備用。

高碳天然氣捕集技術(shù)：以松南高碳天然氣分離捕集裝置為代表，采用MDEA胺法脫碳工藝，將松南高碳?xì)馓铮ǘ趸己?3%）中的二氧化碳捕集分離，生產(chǎn)清潔天然氣，年處理能力達(dá)50萬噸。

2.5.3供試品溶液的制備 取80只果蠅腦部，置于1.5 mL離心管中，加入100 μL 2.5.2項下制備的蛋白沉淀劑，超聲破碎30次，靜置30 min，4 ℃時以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得。

2.5.4混合對照品溶液的配制 精密稱取DA、5-HIAA、HVA 和5-HT對照品各5 mg，分別置于5 mL量瓶中，用2.5.2項下制備的蛋白沉淀劑稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的混合對照品儲備液。臨用前用蛋白沉淀劑稀釋，配制成含DA、5-HIAA、HVA和5-HT質(zhì)量濃度分別為0.20，0.24,0.16和0.16的高質(zhì)量濃度混合對照品溶液；質(zhì)量濃度分別為0.25，0.30，0.20和0.20的中質(zhì)量濃度混合對照品溶液；質(zhì)量濃度分別為0.30，0.36,0.24和0.24的低質(zhì)量濃度混合對照品溶液。

2.5.5色譜條件 色譜柱為Atlantis C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)，流動相為甲醇和緩沖鹽溶液，其中緩沖鹽包括50 mmol·L-1檸檬酸-乙酸鈉，pH值為3.5，內(nèi)含1 mmol·L-1B8離子對試劑、1.8 mmol·L-1二正丁胺和0.3 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉。甲醇與緩沖鹽的比例為4∶96；檢測電壓為0.75 V；柱溫為35 ℃；流速為0.2 mL·min-1。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，實驗結(jié)果采用x±s表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1不同萃取部位對果蠅睡眠時間的影響 與空白組比較，模型組果蠅的總睡眠時間和夜間睡眠時間顯著縮短(P<0.01)，表明失眠模型復(fù)制成功。與模型組比較，陽性藥組果蠅的總睡眠時間、白天睡眠時間以及夜間睡眠時間顯著增加(P<0.01)，百合地黃湯全方組與石油醚部位低劑量組果蠅的總睡眠時間與白天睡眠時間明顯增加(P<0.05)，二氯甲烷部位中劑量組和水飽和正丁醇部位低劑量組果蠅的總睡眠時間、白天睡眠時間和夜間睡眠時間均明顯增加(P<0.05)，乙酸乙酯部位中劑量組果蠅總睡眠時間和夜間睡眠時間增加(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 百合地黃湯不同部位萃取物對果蠅睡眠時間的影響

分組樣本量/只總睡眠時間/min白天睡眠時間/min夜間睡眠時間/min空白組321 020.00±21.88372.84±20.23645.16±8.24模型組32885.25±33.85##354.28±20.57530.97±17.19##陽性藥組321 129.78±20.31??508.28±18.37??621.50±6.18??百合地黃湯全方低劑量組32986.13±23.89?455.50±12.53??530.63±16.87百合地黃湯全方中劑量組321 069.38±25.22??500.06±16.84??569.31±11.84百合地黃湯全方高劑量組321 028.44±23.96??472.47±15.40??555.97±11.56石油醚部位低劑量組321 009.41±22.40??440.91±18.15??568.50±11.56石油醚部位中劑量組32893.28±24.99344.94±19.01548.34±9.97石油醚部位高劑量組30959.67±21.93373.23±18.16586.43±10.62?二氯甲烷部位低劑量組32905.03±17.31340.56±16.16564.47±4.61二氯甲烷部位中劑量組301 053.07±103.12??472.57±91.99??580.50±28.29?二氯甲烷部位高劑量組32897.36±16.18346.30±18.14551.06±9.20乙酸乙酯部位低劑量組32914.09±169.45365.88±111.09548.22±89.97乙酸乙酯部位中劑量組32992.09±170.14?415.88±128.20576.66±62.45?乙酸乙酯部位高劑量組32944.00±137.38387.19±100.65556.81±49.73水飽和正丁醇部位低劑量組32994.34±142.00?409.00±90.78?585.34±81.97?水飽和正丁醇部位中劑量組32967.72±150.42408.31±105.93559.41±53.93水飽和正丁醇部位高劑量組32912.94±175.23396.25±112.00516.69±79.92

注：與空白組比較##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1專屬性實驗 取含0.3 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉和0.5 mmol·L-1亞硫酸鈉的0.1 mol·L-1高氯酸溶液，進(jìn)樣5 μL，作為陰性對照。取2.5.4項下制備的質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的混合對照品溶液，進(jìn)樣5 μL。按照2.5.3項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL。結(jié)果見圖1。

3.2.2檢測限和定量限實驗 取質(zhì)量濃度分別為1 μg·mL-1的DA和5-HT 對照品溶液，用2.5.2項下制備的蛋白沉淀劑稀釋，檢測限S/N≥3，定量限S/N≥10。DA的檢測限和定量限分別為0.035和0.065 ng；5-HIAA的檢測限和定量限分別為0.04和0.08 ng；HVA的檢測限和定量限分別為0.05和0.15 ng；5-HT的檢測限和定量限分別為0.08和0.13 ng。

3.2.3線性關(guān)系考察 取2.5.4項下制備的不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、對照品的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果見表2。

圖1 HPLC圖

A.陰性對照；B.混合對照品；C.供試品溶液；1.DA；2.5-HIAA；3.HVA；4.5-HT。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.negative control；B.mixed reference substances；C.sample；1.DA； 2.5-HIAA；3.HVA；4.5-HT.

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

Tab.2 Results of linear relationships

成分線性范圍/ng線性方程R2DA0.75～3.75y1=1 420 721.23x1-282 690.230.999 75-HIAA0.50～3.00y2=1 636 907.42x2-17 572.880.999 5HVA0.48～6.40y3=1 080 360.82x3-337 756.780.999 65-HT0.20～1.60y4=1 732 475.97x4-142 110.750.999 7

3.2.4穩(wěn)定性實驗 將樣品溶液在4 ℃條件下放置0，2，4，8，12和24 h測定，計算RSD值，結(jié)果樣品溶液的RSD值在1.12%～2.50%之間，表明穩(wěn)定性良好。

3.2.5精密度實驗 精密稱取2.5.4項下制備的高、中、低質(zhì)量濃度混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定并計算RSD值，高、中、低質(zhì)量濃度混合對照品溶液的日內(nèi)精密度在0.98%～1.45%之間，日間精密度在1.98%～9.86%之間，表明精密度均良好。

3.2.6加樣回收率實驗 取樣品9份，分別加入2.5.4項下制備的高、中、低3種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，再按照2.5.3項下方法操作，平行測定，計算平均回收率，結(jié)果見表3。高、中、低質(zhì)量濃度混合對照品的平均回收率在96.18%～107.20%之間，回收率良好。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.3 Results of sample recovery test (n=6)

成分高質(zhì)量濃度平均回收率/%RSD/%中質(zhì)量濃度平均回收率/%RSD/%低質(zhì)量濃度平均回收率/%RSD/%DA107.204.42106.043.9997.345.215-HIAA97.476.6996.1811.01105.306.08HVA99.029.26103.104.29100.622.965-HT103.386.08101.465.8998.665.99

3.3有效部位萃取物對果蠅腦部單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 與空白組比較，模型組果蠅腦部的DA含量明顯升高(P<0.05)，5-HT及代謝物5-HIAA的含量明顯降低(P<0.05)，表明成功復(fù)制失眠模型。與模型組比較，陽性藥組果蠅腦部的DA明顯降低(P<0.05)，5-HT含量升高(P<0.05)，5-HIAA和HVA含量無明顯變化；不同萃取部位對果蠅腦部DA及代謝物HVA的含量具有降低作用，對5-HT及代謝物5-HIAA的含量具有升高作用。結(jié)果見表4。

表4 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定結(jié)果

組別DA/ng·mL-15-HIAA/ng·mL-1HVA/ng·mL-15-HT/ng·mL-1空白組472.93±21.64122.37±6.55356.10±10.20304.08±2.87模型組683.63±42.12#61.97±1.85#348.57±11.07110.30±3.19###陽性藥組364.42±9.27?61.91±1.39308.07±3.94218.03±11.56?百合地黃湯全方中劑量組297.01±7.28?415.09±8.33??211.98±24.71?201.91±6.12?石油醚部位低劑量組396.80±9.61233.43±4.12?244.92±5.15?178.54±5.18?二氯甲烷部位中劑量組267.62±19.52?279.65±4.28??188.94±0.19??179.17±12.28?乙酸乙酯部位中劑量組363.46±14.00?199.45±1.66???224.27±7.46??139.52±26.86水飽和正丁醇部位低劑量組380.52±6.40210.29±1.67??289.98±2.88138.85±10.26

注：與空白組比較#P<0.05，###P<0.001；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4 討論

果蠅睡眠與哺乳動物的睡眠具有很多相同的基本特征[13]，且具有繁殖周期短、易于飼養(yǎng)等作為模式生物的獨特優(yōu)勢[18]。本實驗采用果蠅監(jiān)測裝置，研究百合地黃湯全方及不同萃取部位對果蠅睡眠的改善作用。結(jié)果表明，百合地黃湯全方低、中、高劑量組、石油醚部位低劑量組、二氯甲烷部位中劑量組、乙酸乙酯部位中劑量組和水飽和正丁醇部位低劑量組果蠅的總睡眠時間明顯延長；其中，百合地黃湯全方中劑量組和石油醚部位低劑量組果蠅的白天睡眠時間延長，夜間睡眠時間未見明顯變化，二氯甲烷部位中劑量組、乙酸乙酯部位中劑量組和水飽和正丁醇部位低劑量組果蠅的夜間睡眠時間明顯延長(P<0.05)，據(jù)此推測百合地黃湯各有效部位治療失眠的作用機(jī)制可能并不完全相同。

研究表明[19]，DA、HVA、5-HT和5-HIAA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對于睡眠的調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵的作用。其中，5-HT是促進(jìn)睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)[20-22]，主要分布于大腦皮層和神經(jīng)突觸[23]，5-HIAA是5-HT的代謝終產(chǎn)物，故腦內(nèi)5-HIAA的含量可間接地反映5-HT的含量變化[24]。DA是一種興奮性遞質(zhì)，其濃度升高可導(dǎo)致失眠[25-26]，HVA是DA的代謝終產(chǎn)物，HVA含量與DA含量呈正相關(guān)，腦內(nèi)HVA含量可間接反映DA的含量變化[27-28]。本實驗對各有效部位鎮(zhèn)靜催眠作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，與模型組比較，陽性藥組果蠅腦部的DA含量明顯降低(P<0.05)，5-HT含量明顯升高(P<0.05)，5-HIAA和HVA含量無明顯變化；百合地黃湯全方中劑量組和二氯甲烷部位中劑量組果蠅腦部的DA和HVA含量明顯降低(P<0.05)，5-HT和5-HIAA的含量明顯升高(P<0.05)；石油醚部位低劑量組果蠅腦部的DA含量有降低趨勢，但無明顯差異，5-HT和5-HIAA的含量明顯升高(P<0.05)；乙酸乙酯部位中劑量組果蠅腦部的DA和HVA含量明顯降低(P<0.05)，5-HT的含量有升高趨勢，但無明顯差異；水飽和正丁醇部位組果蠅腦部的DA有降低趨勢，5-HT的含量有升高趨勢，但無明顯差異。

本實驗已篩選出百合地黃湯鎮(zhèn)靜催眠的有效部位，各有效部位發(fā)揮其治療失眠的作用可能與調(diào)節(jié)果蠅腦部單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量相關(guān)，但其治療失眠的作用機(jī)制尚不明確，本課題組將針對該問題進(jìn)一步研究。