三磷酸腺苷二鈉片對(duì)慢性高原病模型大鼠多器官損傷的改善作用

楊 濤，史 超，艾尼娃爾·艾克木，是文輝，張向陽(yáng)，迪麗努爾·買(mǎi)買(mǎi)提依明*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合心臟內(nèi)科，烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011；4.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

慢性高原病(CMS)或蒙赫氏病是世界上多數(shù)高海拔地區(qū)高度流行的進(jìn)行性喪失能力綜合征[1-2]。世界上有超過(guò)1億4 000萬(wàn)人生活在海拔2 500 m以上地區(qū)，其中5%～10%的人有患CMS的風(fēng)險(xiǎn)。三磷酸腺苷二鈉片(ADT)是核苷酸衍生物，參與機(jī)體內(nèi)的多種代謝。研究表明[3-5]，三磷酸腺苷二鈉片對(duì)缺血缺氧再灌注腎臟和腦損傷具有不同程度的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)擬在模擬高海拔環(huán)境，構(gòu)建慢性高原病模型，灌胃不同劑量的三磷酸腺苷二鈉片，測(cè)定各組大鼠的肺動(dòng)脈壓力(PAP)，檢測(cè)血清中細(xì)胞因子內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和一氧化氮(NO)的含量，觀察腎、腦和肺的病理學(xué)改變，并測(cè)定各組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)水平，旨在研究三磷酸腺苷二鈉片對(duì)長(zhǎng)期暴露于高原環(huán)境中所致多種器官損傷的改善作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 Model 680型酶標(biāo)儀，1575型immunowash微孔板洗板機(jī)(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；LEICA EM UC6型切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙，位于新疆軍區(qū)總醫(yī)院。

1.2試藥 三磷酸腺苷二鈉片(成都天臺(tái)山制藥有限公司，批號(hào)120601)；硝苯地平片(山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)C120304)。大鼠NO Elisa試劑盒(批號(hào)NH163CS)、大鼠VEGF Elisa 試劑盒(批號(hào)3203040)、大鼠ET-1 Elisa試劑盒(批號(hào)8264255)，均購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司。SOD(批號(hào)20130410)、MDA(批號(hào)20130409)和GSH-Px(批號(hào)20130401)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物 SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量為180±20 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(新)2011-0004。

2 方法

2.1CMS模型大鼠的建立和分組 將60只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、硝苯地平組及三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組。

CMS模型：將除對(duì)照組外的5組大鼠放入人工實(shí)驗(yàn)艙飼養(yǎng)，每組10只。模擬海拔5 000 m；溫度：20±2 ℃；濕度：40%±10%；壓力：54.1 kPa；氧分壓：13.01 kPa。飼養(yǎng)30 d后給予以下處理：模型組：給予蒸餾水4 mL·kg-1·d-1，灌胃15 d；硝苯地平組：給予硝苯地平2.7 mg·kg-1·d-1，灌胃15 d；三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組分別給予三磷酸腺苷二鈉 片3.239 8，1.619 9和0.809 9 mg·kg-1·d-1，灌胃 15 d。

對(duì)照組：將10只SD大鼠放入SPF環(huán)境中，模擬海拔730 m；溫度：22±4 ℃；濕度：40%～60%；壓力：93.2 kPa；氧分壓為：19.54 kPa。飼喂30 d后，給予蒸餾水4 mL·kg-1·d-1，灌胃15 d。

2.2CMS模型大鼠PAP的測(cè)定 最后一次干預(yù)治療24 h后，大鼠采用常規(guī)麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，完全將心肺露出，采用自制壓力測(cè)定器測(cè)定大鼠PAP，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3CMS模型大鼠血清指標(biāo)的測(cè)定 打開(kāi)大鼠腹腔，完全暴露腹主動(dòng)脈后采血，在常溫環(huán)境下靜置30 min，以3 000 r·min-1離心20 min，吸取血清，依照說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)血清中ET-1、VEGF和NO的含量。

2.4大鼠各組織的病理學(xué)檢查 摘取大鼠的肺和大腦，使用蘇木精-伊紅染色法，觀察其病理學(xué)改變。

2.5大鼠各組織中MDA、SOD與GSH-Px活性及水平的測(cè)定 將2.4項(xiàng)下摘取的器官制備成10%的細(xì)胞混懸液，在低溫條件下以3 000 r·min-1離心20 min，棄掉沉淀物，分別用Elisa試劑盒檢測(cè)MDA、SOD與GSH-Px的活性及水平。

3 結(jié)果

3.1CMS模型大鼠PAP的檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組、硝苯地平組和三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠PAP均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相較于模型組，硝苯地平組大鼠PAP明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組PAP明顯上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與硝苯地平組比較，三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組PAP顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CMS大鼠肺動(dòng)脈壓力的檢測(cè)結(jié)果

組別肺動(dòng)脈壓力/mmHg對(duì)照組20.36±2.31模型組43.17±3.46a硝苯地平組29.45±3.14ab三磷酸腺苷二鈉片高劑量組34.21±4.21abc三磷酸腺苷二鈉片中劑量組35.75±4.02abc三磷酸腺苷二鈉片低劑量組36.34±4.12abc

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與硝苯地平組比較cP<0.05。

3.2CMS模型大鼠血清中VEGF、NO和ET-1的含量測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組、硝苯地平組、三磷酸腺苷二鈉片中、低劑量組大鼠血清VEGF和ET-1含量明顯升高(P<0.05)；三磷酸腺苷二鈉片高劑量組大鼠血清VEGF含量顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，硝苯地平組和三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠血清中VEGF和ET-1含量顯著下降(P<0.05)。與硝苯地平組比較，三磷酸腺苷二鈉片高、中劑量組大鼠血清VEGF和ET-1含量顯著下降(P<0.05)；三磷酸腺苷二鈉片低劑量組大鼠血清中VEGF含量顯著下降(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，模型組、硝苯地平組以及三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠血清NO含量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，硝苯地平組、三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠血清NO含量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3.3病理學(xué)檢查結(jié)果

3.3.1腦組織 對(duì)照組大鼠腦組織在低倍鏡下可見(jiàn)腦膜較薄，未見(jiàn)充血、出血和脫落情形；在高倍鏡下可見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)錐體細(xì)胞層部分血管輕度出血，未見(jiàn)明顯異常改變。多數(shù)錐體細(xì)胞大小正常，未見(jiàn)明顯變形。模型組大鼠腦組織在低倍鏡下可見(jiàn)腦膜血管下擴(kuò)張充血嚴(yán)重，腦實(shí)質(zhì)血管周?chē)粩U(kuò)張，內(nèi)有滲出液；在高倍鏡下可見(jiàn)大腦錐體細(xì)胞增大部分血管管腔擴(kuò)張并小范圍水腫。硝苯地平組大鼠腦組織在低倍鏡下腦膜內(nèi)未見(jiàn)異常滲出物附著，腦膜血管未見(jiàn)出血和水腫等情形；在高倍鏡下可見(jiàn)大部分腦實(shí)質(zhì)血管管腔擴(kuò)張并充血。三磷酸腺苷二鈉片低劑量組大鼠腦組織在低倍鏡下可見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)外錐體細(xì)胞層部分血管明顯擴(kuò)張充血；在高倍鏡下可見(jiàn)近出血部位腦實(shí)質(zhì)疏松腫脹。三磷酸腺苷二鈉片中劑量組大鼠腦組織在低倍鏡下腦膜內(nèi)未見(jiàn)明顯異常滲出物附著現(xiàn)象，海馬區(qū)部分神經(jīng)元排列紊亂；在高倍鏡下腦實(shí)質(zhì)未見(jiàn)明顯異常。三磷酸腺苷二鈉片高劑量組大鼠腦組織在低倍鏡下可見(jiàn)腦膜內(nèi)輕度出血；在高倍鏡下腦實(shí)質(zhì)外錐體細(xì)胞層未見(jiàn)明顯異常，腦實(shí)質(zhì)存在輕度水腫，病變程度比三磷酸腺苷二鈉片低劑量組略輕。見(jiàn)圖1。

表2 各組大鼠血清中VEGF、NO和ET-1含量的測(cè)定結(jié)果

組別VEGF/pg·mL-1ET-1/pg·mL-1NO/μmol·mL-1對(duì)照組45.36±3.2152.36±4.2828.36±2.78模型組182.32±8.62a93.25±3.65a14.25±2.45a硝苯地平組 133.74±5.37ab72.89±1.55ab 21.71±1.64ab三磷酸腺苷二鈉片高劑量組103.62±4.18abc56.37±3.54bc24.14±2.01ab三磷酸腺苷二鈉片中劑量組86.85±4.36abc67.25±5.65abc 23.07±1.98ab三磷酸腺苷二鈉片低劑量組78.17±3.56abc73.24±3.66ab21.37±1.22ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與硝苯地平組比較cP<0.05。

3.3.2肺組織 對(duì)照組大鼠肺組織在低倍鏡下結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁較薄，肺泡腔清晰；在高倍鏡下部分肺泡間隔輕微增厚，無(wú)明顯病理改變，未見(jiàn)肺泡間隔增生、充血等異常改變。模型組大鼠肺組織在低倍鏡下可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增生；在高倍鏡下肺組織部分血管擴(kuò)張充血，個(gè)別肺泡腔內(nèi)有滲出液且充血，肺間質(zhì)水腫并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。硝苯地平組在低倍鏡下可見(jiàn)部分肺泡間隔明顯增厚；在高倍鏡下可見(jiàn)肺泡壁增厚，部分肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。三磷酸腺苷二鈉片低劑量組大鼠肺組織在低倍鏡下可見(jiàn)肺泡壁較薄，肺泡腔清晰；在高倍鏡下部分肺泡間隔毛細(xì)血管擴(kuò)張出血，部分肺泡塌陷，部分肺泡代償性擴(kuò)張。三磷酸腺苷二鈉片中劑量組大鼠肺組織在低倍鏡下可見(jiàn)肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡塌陷；在高倍鏡下存在肺泡間隔毛細(xì)血管擴(kuò)張出血。三磷酸腺苷二鈉片高劑量組大鼠肺組織在低倍鏡下可見(jiàn)肺泡壁增厚，肺泡腔不清，部分肺泡腔內(nèi)有滲出液；在高倍鏡下可見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

圖1 腦組織病理學(xué)結(jié)果

A.對(duì)照組(×100)；B.對(duì)照組(×400)；C.模型組(×100)；D.模型組(×400)；E.硝苯地平組(×100)；F.硝苯地平組(×400)；G.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×100)；H.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×400)；I.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×100)；J.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×400)；K.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×100)；L.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×400)。

Fig.1 Pathological results of brain tissue

A.control group(×100)；B.control group(×400)；C.model group(×100)；D.model group(×400)；E.nifedipine group(×100)；F.nifedipine group(×400)；G.HADT group(×100)；H.HADT group(×400)；I.MADT group(×100)；J.MADT group(×400)；K.LADT group(×100)；L.LADT group(×400).

圖2 肺組織病理學(xué)結(jié)果

A.對(duì)照組(×100)；B.對(duì)照組(×400)；C.模型組(×100)；D.模型組(×400)；E.硝苯地平組(×100)；F.硝苯地平組(×400)；G.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×100)；H.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×400)；I.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×100)；J.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×400)；K.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×100)；L.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×400)。

Fig.2 Pathological results of lung tissue

A.control group(×100)；B.control group(×400)；C.model group(×100)；D.model group(×400)；E.nifedipine group(×100)；F.nifedipine group(×400)；G.HADT group(×100)；H.HADT group(×400)；I.MADT group(×100)；J.MADT group(×400)；K.LADT group(×100)；L.LADT group(×400).

3.4大鼠各組織中MDA、SOD與GSH-Px的活性與水平 與對(duì)照組比較，模型組、硝苯地平組、三磷酸腺苷二鈉片高、中和低劑量組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)；MDA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，硝苯地平組以及三磷酸腺苷二鈉片高、中和低劑量組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)；MDA水平顯著降低(P<0.05)。與硝苯地平組比較，三磷酸腺苷二鈉片高、中劑量組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)；MDA水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 肺組織中MDA、GSH-Px和SOD測(cè)定結(jié)果

組別MDA/nmol·mg-1SOD/U·mg-1GSH-Px/U·mg-1對(duì)照組9.24±1.02130.54±17.41240.37±20.36模型組14.14±1.45a60.44±12.34a83.21±14.27a硝苯地平組12.36±1.24ab80.45±17.21ab154.17±15.88ab三磷酸腺苷二鈉片高劑量組9.36±1.54bc128.21±11.14bc230.14±21.54bc三磷酸腺苷二鈉片中劑量組10.33±1.71abc100.41±16.42abc180.45±17.14abc三磷酸腺苷二鈉片低劑量組12.74±1.24abc70.45±13.25abc172.45±14.21abc

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與硝苯地平組比較cP<0.05。

4 討論

抗氧化酶活性的改變和非酶抗氧劑的減少都會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]。正常的生物過(guò)程不斷產(chǎn)生活性氧，活性氧可被機(jī)體的抗氧化酶，包括SOD、GSH-Px和一些保護(hù)性化合物清除。總超氧化物歧化酶(T-SOD)和GSH-Px是通過(guò)氧自由基向過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為自由基的天然清除劑[8-10]。為了消除來(lái)自細(xì)胞環(huán)境的破壞性活性氧物種。通過(guò)測(cè)定T-SOD和GSH-Px等主要抗氧化酶可以明確機(jī)體的抗氧化狀態(tài)。丙二醛(MDA)已被廣泛用作生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)生物過(guò)程中的脂質(zhì)過(guò)氧化，盡管人們認(rèn)為它隨著各種疾病的增加而與自由基損傷有關(guān)[11-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CMS模型組大鼠肺組織中GSH-Px和SOD活性降低，MDA水平升高，表明大鼠長(zhǎng)期暴露于低壓低氧環(huán)境中，會(huì)對(duì)機(jī)體肺和腦等重要器官造成氧化損傷。采用三磷酸腺苷二鈉片干預(yù)治療后，三磷酸腺苷二鈉低、中、高劑量組大鼠肺、腎組織中GSH-Px和SOD活性均不同程度增強(qiáng)，MDA水平不同程度下降，表明三磷酸腺苷二鈉片可提高機(jī)體中抗氧化酶的活性，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)CMS大鼠多種重要器官造成的損傷。

VEGF是具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用的因子[14-15]，其在低氧環(huán)境下不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，還可增加血管通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CMS模型大鼠VEGF含量升高，給予三磷酸腺苷二鈉片后，三磷酸腺苷二鈉片低、中和高劑量組VEGF含量均不同程度降低。NO是由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)催化2-氨基-5-胍基戊酸脫去胍基所產(chǎn)生的血管舒張因子[16]；內(nèi)皮素(Endothelin，ET)是維持心血管功能的重要物質(zhì)，ET-1是內(nèi)皮素家族血管收縮作用最強(qiáng)大的物質(zhì)[17-20]。通常ET與NO在機(jī)體內(nèi)保持著動(dòng)態(tài)平衡，ET可通過(guò)增加鈣離子內(nèi)流，促使NO產(chǎn)生，從而擴(kuò)張血管；NO則可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞生成鳥(niǎo)苷-3′，5′-環(huán)化-磷酸(cGMP)，從而抑制ET的合成和釋放[21-22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CMS模型大鼠血清的ET-1含量升高，NO含量降低，給予三磷酸腺苷二鈉片干預(yù)后，三磷酸腺苷二鈉片低、中、高劑量組ET-1含量均不同程度降低，NO含量不同程度升高。提示CMS模型大鼠體內(nèi)ET和NO含量處于失衡狀態(tài)，從而使PAP升高，引起多種臟器的損傷，給予三磷酸腺苷二鈉片后，失衡狀態(tài)有所改善。

綜上所述，機(jī)體長(zhǎng)期暴露于高原環(huán)境中，低壓低氧會(huì)引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機(jī)體重要器官損傷，三磷酸腺苷二鈉片對(duì)這種氧化應(yīng)激反應(yīng)具有不同程度的改善作用。