UPLC法同時(shí)測(cè)定丹參片中6種酚酸類成分的含量

秦學(xué)玲，楊璐璐，馬 娜，蔣新平，秦興衛(wèi)

(1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，昆明 650011；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二○醫(yī)院，昆明 650032；3.云南百康藥業(yè)有限公司，昆明 650106；4.昆明賽諾制藥股份有限公司，昆明 650011)

丹參片具有活血化瘀的作用[1]，臨床主治各種心血管系統(tǒng)疾病[2-5]。軍事訓(xùn)練中急性損傷后期或軟組織慢性損傷，有瘀斑或瘀血并伴腫痛者，口服丹參片有活血化瘀及緩解腫痛的作用。研究表明，酚酸類成分是丹參片中的主要有效成分[6]，其中丹酚酸A和丹酚酸B的活性最強(qiáng)。丹參片在《中國(guó)藥典》2015年版一部中的含量測(cè)定項(xiàng)為HPLC法測(cè)定丹參中丹酚酸B的含量[1]，因此，酚酸類成分是控制丹參片質(zhì)量的重要指標(biāo)成分。

丹參及丹參片中的丹參酮類成分和酚酸類成分的含量測(cè)定方法已有報(bào)道[6-19]，一般采用HPLC法或高效毛細(xì)管電泳法對(duì)丹參片中原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、原兒茶酸乙酯、丹酚酸B和丹酚酸A進(jìn)行測(cè)定。李耿等[20]采用UPLC法在檢測(cè)波長(zhǎng)分別為265和280 nm處同時(shí)測(cè)定丹參藥材中多種成分的含量。本實(shí)驗(yàn)以探究丹參片質(zhì)量控制為關(guān)鍵，以多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量為出發(fā)點(diǎn)，將快速、簡(jiǎn)便、高效、靈敏的方法運(yùn)用到產(chǎn)品的質(zhì)量控制中。運(yùn)用UPLC法對(duì)本次國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)的8個(gè)不同廠家74批次丹參片樣品，在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm處對(duì)6種酚酸類成分(丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A)的含量進(jìn)行測(cè)定，在16 min內(nèi)能同時(shí)快速、準(zhǔn)確地測(cè)定丹參片中6種酚酸類成分的含量。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可快速、有效地控制丹參片的質(zhì)量，節(jié)約分析時(shí)間，為丹參片的質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 超高效液相色譜(UPLC)Agilent Technologies 1290 lnfinity系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫公司)； 色譜柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國(guó)Waters公司)；Mettler AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 丹參素鈉(批號(hào)110855-201311)、迷迭香酸(批號(hào)111871-201102)、丹酚酸B(批號(hào)111562-201514)和原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)110810-200506)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹酚酸A(批號(hào)96574-01-5)和紫草酸對(duì)照品(批號(hào)28831-65-4)，均購(gòu)自西亞公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；乙腈為色譜純(美國(guó)Merck公司)；水為自制高純水；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；丹參片為2015年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)抽取的樣品(批號(hào)150305，寧夏啟元國(guó)藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.812 5，0.083 2，0.351 6，0.341 2，0.503 4和0.501 5 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備 取丹參片樣品適量，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，精密稱取0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率280 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.2 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3陰性樣品溶液的制備 取缺丹參的陰性樣品，按照2.2項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液，即得。

2.4色譜條件 采用Waters BEH C18(100 mm×2．1 mm，1．7 μm)色譜柱。以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～14 min，6%B→23%B；14～20 min，23%B→39%B)。柱溫：25 ℃；樣品管理器溫度：4 ℃；流速：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5線性關(guān)系考察 取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣0.25，0.50，1.00,2.00，5.00,8.00和10.00 μL，以峰面積(y)對(duì)進(jìn)樣量(x)進(jìn)行線性回歸，求得工作曲線，得到丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的回歸方程分別為：y1=2 234.1x1-11.936(r1=1.000 0)；y2=10 776x2+0.947 7(r2=0.999 9)；y3=1 195.5x3-7.789 2(r3=1.000 0)；y4=1 516.8x4-7.963 7(r4=0.999 9)；y5=1 913.3x5+6.303 4(r5=1.000 0)；y6=3 712.4x6+38.304(r6=0.999 9)。線性范圍分別為0.203 1～8.125 0，0.020 8～0.832 0，0.087 9～3.516 0，0.085 3～3.412 0，0.125 8～5.034 0和0.125 4～5.015 0 μg。

圖1 HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.丹參片樣品；C.陰性樣品；1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.迷迭香酸；4.紫草酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸A。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.Danshen Tablets sample；C.negative sample；1.tanshinol；2.protocatechuic aldehyde；3.rosmarinci acid；4.lithospermic acid；5.salvianolic acid B；6.salvianolic acid A.

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2 μL，測(cè)定峰面積值，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A峰面積的RSD值分別為0.73%，0.71%，0.41%，0.68%，0.16%和0.96%。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，于0，2，4，8，12和24 h分別進(jìn)樣2 μL測(cè)定，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A峰面積的RSD值分別為0.03%，0.23%，0.10%，0.68%，0.11%和0.07%。表明供試品溶液中的6種待測(cè)成分在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取丹參片樣品(批號(hào)150305)，按照2.2項(xiàng)下方法平行制得6份供試品溶液，按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣2 μL測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的平均含量分別為7.009，0.799，3.275，3.048，35.480和4.438 mg·g-1，RSD值分別為0.01%，0.09%，0.05%，0.09%，0.01%和0.02%。表明其重復(fù)性良好。

2.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取丹參片樣品(批號(hào)150305)，6份，每份0.1 g，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A質(zhì)量濃度分別為71.21，8.12，32.81，30.59，354.03和44.52 μg·mL-1的對(duì)照品溶液10 mL，再加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液50 mL，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣2 μL，測(cè)定。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的平均回收率(n=6)分別為99.2%，99.6%，99.5%，98.7%，99.3%和98.9%，RSD值分別為0.49%，0.79%，0.48%，0.92%，0.40%和0.88%。表明該方法回收率良好。

2.10樣品的測(cè)定 取8個(gè)廠家74批次丹參片樣品，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.4項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣2 μL測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 74批次丹參片中6種酚酸類成分的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.1 The results of content determination of 6 phenolic acids in 74 batches Danshen Tablets

樣品編號(hào)含量/mg·片-1丹參素鈉原兒茶醛迷迭香酸紫草酸丹酚酸B丹酚酸A總含量SCG201500031.040.130.760.8713.220.9416.96SCG201500191.820.160.801.1012.251.3917.52SCG201500201.770.140.720.8610.101.3514.94SCG201500461.660.190.871.1012.311.4517.58SCG201500861.470.130.880.9812.711.3117.48SCG201500961.690.170.821.1113.061.5018.35SCG201501051.660.180.921.0813.881.5619.28SCG201501462.290.250.810.869.951.8816.04SCG201501471.740.210.871.1512.701.6418.31SCG201501481.470.150.880.9010.651.0615.11SCG201501631.400.130.981.1314.311.3119.26SCG201502061.720.140.871.2113.441.5418.92SCG201502071.440.140.881.0212.461.0917.03SCG201502081.730.170.811.1612.731.4418.04SCG201502091.480.150.870.9612.441.1417.04SCG201502101.740.180.860.9811.531.3416.63SCG201502111.800.160.791.1412.451.5117.85SCG201502481.540.160.881.1213.941.4019.04SCG201502491.780.150.751.0612.121.5817.44SCG201502501.740.160.781.0212.381.5317.61SCG201502921.820.180.841.0812.391.4517.76SCG201502981.520.140.871.1013.561.5018.69SCG201502991.520.150.861.0813.651.2718.53SCG201503571.670.130.690.809.401.1113.80SCG201503731.730.180.851.0011.671.2716.70SCG201504111.860.160.890.749.410.9814.04SCG201504501.520.160.981.0712.161.1717.06SCG201504511.690.150.871.1112.431.1517.40SCG201504851.790.170.831.1312.491.3317.74SCG201504861.670.160.801.0411.801.2316.70SCG201504901.870.271.361.2414.991.1820.91SCG201501450.840.040.870.9911.620.6715.03SCG201501490.770.030.891.2115.190.7518.84SCG201501500.810.030.851.1014.450.7317.97SCG201501510.900.070.851.0111.760.6915.28SCG201502470.790.030.811.0814.140.6917.54

表1(續(xù)) 74批次丹參片中6種酚酸類成分的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.1 (Continued) The results of content determination of 6 phenolic acids in 74 batches Danshen Tablets (mg·片-1)

樣品編號(hào)含量/mg·片-1丹參素鈉原兒茶醛迷迭香酸紫草酸丹酚酸B丹酚酸A總含量SCG201503030.850.020.601.0013.050.6916.21SCG201503500.810.040.871.0914.370.7317.91SCG201503510.790.040.871.0411.920.6815.34SCG201503520.780.020.820.9913.080.5416.23SCG201503530.810.040.881.0511.960.6715.41SCG201503930.800.020.911.2015.220.7118.86SCG201504830.640.031.281.3714.750.6318.70SCG201504840.660.031.301.3614.750.6118.71SCG201500040.190.020.860.868.560.1410.13SCG201500400.250.050.750.7511.490.2413.34SCG201500830.200.010.870.878.920.1510.54SCG201505040.170.040.910.9112.090.1813.86SCG201503720.180.021.081.0811.340.1413.16SCG201503890.180.031.041.0411.330.1413.13SCG201504000.240.061.081.087.300.109.00SCG201504910.180.041.051.0511.400.1413.21SCG201502930.190.050.940.9411.960.1913.78SCG201500850.280.010.490.357.420.188.72SCG201503010.310.020.510.346.930.228.31SCG201503150.390.010.790.4710.430.2412.32SCG201503160.270.050.470.305.940.217.19SCG201504250.390.030.490.6013.890.2915.69SCG201500841.600.151.061.1814.690.5319.21SCG201502562.320.191.030.9012.411.1017.93SCG201503281.520.141.001.0914.610.5518.91SCG201504092.080.151.011.0214.171.1119.56SCG201500090.400.020.730.6013.030.3015.08SCG201502220.240.010.740.4512.400.2214.06SCG201503440.280.010.780.4612.300.2314.06SCG201503040.330.010.980.8214.290.3216.75SCG201504101.660.171.191.1217.351.0922.58SCG201504650.430.011.040.8014.310.3216.91SCG201504741.770.181.201.1317.241.0422.56SCG201500450.310.010.910.7714.550.3416.89SCG201500510.200.010.910.6814.050.3316.18SCG201502650.260.010.770.5114.710.3116.57SCG201502700.220.010.790.5314.470.2816.30SCG201503002.710.291.241.2515.592.3523.43

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 分別以甲醇、體積分?jǐn)?shù)分別為50%，70%，75%和90%的甲醇超聲提取30 min。結(jié)果體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇提取率最高，故選擇體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇作為提取溶劑。

3.2提取方法的選擇 以體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇為提取溶劑，分別超聲15，30和60 min及加熱回流0.5，1.0和2.0 h。結(jié)果表明，超聲提取與加熱回流提取效果相當(dāng)，超聲30與60 min效果相當(dāng)，故提取方法確定為超聲提取30 min。

3.3流動(dòng)相種類的選擇 分別考察了甲醇-1 mL·L-1甲酸、甲醇-1 mL·L-1磷酸和乙腈-1 mL·L-1甲酸、乙腈-1 mL·L-1磷酸4種流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用乙腈-1 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相效果最佳。

3.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用UPLC-DAD檢測(cè)器，設(shè)定波長(zhǎng)范圍200～400 nm對(duì)樣品進(jìn)行掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)λ=280 nm時(shí)樣品的吸收峰最多，峰形最好，因此選用λ=280 nm作為6個(gè)成分含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 小結(jié)

現(xiàn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)存在只測(cè)定某一成分的含量，影響了中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的整體性和合理性。本文對(duì)丹參片中6個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，可以從整體上反映丹參片的質(zhì)量，節(jié)約提取溶劑并縮短分析時(shí)間。