腦得生片中10種成分的定量研究

崔小麗，山 媛，蔣 鋒，王 莉，張 強(qiáng)，趙 瑞

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，西安 710068)

腦得生片由三七、紅花、葛根、川芎和山楂5 味藥組成，具有醒腦、活血、開(kāi)竅和化淤等功效，臨床主治腦血管疾病及其相關(guān)癥狀；本制劑收載于《中國(guó)藥典》[1]。三七皂苷是三七的主要有效成分，如三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1等，具有抗心腦缺血、抗血栓形成、改善微循環(huán)和調(diào)脂降壓等作用[2-8]；葛根黃酮是葛根的主要功效成分，如3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元等，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管和腦血管以及促進(jìn)血液循環(huán)等多種藥理作用[9-15]；紅花能降低腦卒中的發(fā)生率及死亡率，對(duì)腦梗死等有保護(hù)作用[16-19]；川芎有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等作用[20-21]；山楂具有降脂、降壓和強(qiáng)心等作用[22-23]。本院患者使用該制劑，反映良好。同時(shí)，經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)對(duì)該制劑10種功效成分3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷、三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和大豆苷元同時(shí)定量分析的研究報(bào)道。因此，筆者采用HPLC法對(duì)腦得生片中上述10種活性成分進(jìn)行定量分析。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010CH型高效液相色譜儀，Labsoluion色譜工作站，均購(gòu)自日本島津公司；XSE105DU型電子分析天平，購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200E型超聲波發(fā)生器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2試藥 乙腈、甲醇，HPLC級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；超純水為自制；3′-羥基葛根素 (批號(hào)HH148457，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)、葛根素芹菜糖苷(批號(hào)HM148523，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)、3′-甲氧基葛根素(批號(hào)HA060106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)、大豆苷元(批號(hào)HD031188，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，均購(gòu)自寶雞市辰光生物科技有限公司；葛根素(批號(hào)110752-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.4%)、大豆苷(批號(hào)111738-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.3%)、染料木苷(批號(hào)170911-201702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%)、人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-201424，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.7%)、三七皂苷Rb1(批號(hào)110745-201619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.0%)和人參皂苷Rg1(批號(hào)110704-201726，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.1%)對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；腦得生片(批號(hào)分別為：20170515，20170516，20170517，20170518，20170519，20170520，20170521，20170522，20170523和20170524)，均由哈爾濱華雨制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-2.0 g·L-1磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～20 min，5%→25%A；20～45 min，25%→40%A；45～70 min，35%→55%A；70～90 min，55%→100%A。記錄時(shí)間為90 min。體積流量：0.8 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250與203 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷、三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和大豆苷元6.12，6.29，3.37，4.18，4.29，2.56，6.63，9.22，2.86和7.47 mg，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 取本品20片，除去糖衣，研細(xì)，混勻，精密稱(chēng)取1 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4線(xiàn)性關(guān)系 分別精密量取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液50，200，400，800和1 000 μL，分別置于1 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣測(cè)定。以各對(duì)照品的峰面積值為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，表明各對(duì)照品在對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 對(duì)照品的線(xiàn)性方程、質(zhì)量濃度范圍及相關(guān)系數(shù)

Tab.1 Linear equations，concentration ranges and correlation coefficients of the reference substances

對(duì)照品名稱(chēng)線(xiàn)性范圍/μg·mL-1 線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)(r)3′-羥基葛根素14.99～299.88y1=15 760.4x1+7 873.70.999 5葛根素15.00～300.03y2=51 177.7x2-49 454.80.999 8葛根素芹菜糖苷8.26～165.13y3=11 552.2x3+2 517.10.999 93′-甲氧基葛根素10.24～204.82y4=12 901.3x4-11 290.90.999 5大豆苷10.01～200.13y5=12 072.9x5-2 938.20.999 6染料木苷6.40～128.00y6=12 146.4x6-13 329.30.999 5三七皂苷Rb115.75～314.93y7=3 415.6x7+5 970.60.999 6人參皂苷Rg121.00～419.97y8=2 260.9x8+3 847.50.999 8大豆苷元7.01～140.14y9=23 833.8x9-7 538.90.999 6人參皂苷Rb117.50～349.97y10=3 415.6x10+6 633.90.999 6

2.5專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 依據(jù)處方，分別制備缺葛根和三七藥材的制劑，再按照2.3項(xiàng)下方法分別制備缺葛根和三七的陰性對(duì)照溶液。缺葛根和三七藥材的陰性對(duì)照溶液均無(wú)干擾，表明本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)20170515)，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷、三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、大豆苷元和人參皂苷Rb1的RSD值分別為1.04%，0.91%，0.96%，1.11%，0.92%，0.95%，1.02%，0.91%，0.85%和0.87%，表明該方法精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份樣品(批號(hào)20170515)，分別按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷、三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、大豆苷元和人參皂苷Rb1的平均含量和RSD值見(jiàn)表2，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

圖1 HPLC圖

A.250 nm混合對(duì)照品溶液；B.203 nm混合對(duì)照品溶液；C.250 nm腦得生片；D.203 nm腦得生片；E.250 nm腦得生片(缺三七藥材)；F.203 nm腦得生片(缺三七藥材)；G.250 nm腦得生片(缺葛根藥材)；H.203 nm腦得生片(缺葛根藥材)；1.3′-羥基葛根素；2.葛根素；3.葛根素芹菜糖苷；4.3′-甲氧基葛根素；5.大豆苷；6.染料木苷；7.三七皂苷Rb1；8.人參皂苷Rg1；9.大豆苷元；10.人參皂苷Rb1。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.250 nm mixed reference substance；B.203 nm mixed reference substance；C.250 nm Naodesheng Tablets；D.203 nm Naodesheng Tablets；E.250 nm Naodesheng Tablets(missingRadixnotoginseng)；F.203 nm Naodesheng Tablets(missingRadixnotoginseng)；G.250 nm Naodesheng Tablets(missingRadixpuerariae)；H.203 nm Naodesheng Tablets(missingRadixpuerariae)；1.3′-hydroxy puerarin；2.puerarin；3.puerarin apioside；4.3′-methoxy puerarin；5.daidzin；6.genistin；7.notoginsenoside Rb1；8.ginsenoside Rg1；9.isoflavoues aglycone；10.ginsenoside Rb1.

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液(批號(hào)20170515)，分別在第0，2，4，8，12、24和48 h進(jìn)樣。結(jié)果顯示，3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷、三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、大豆苷元和人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.02%，0.89%，1.11%，1.19%，1.06%，0.98%，0.78%，0.80%，0.95%和1.18%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取腦得生片(批號(hào)20170515)1 g，分別按照表3添加混合對(duì)照品，再加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇定容至刻度，按照2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Results of sample reapeatability test

實(shí)驗(yàn)號(hào)含量/mg·g-13′-羥基葛根素葛根素葛根素芹菜糖苷3′-甲氧基葛根素大豆苷染料木苷三七皂苷Rb1人參皂苷Rg1大豆苷元人參皂苷Rb117.5013.258.2510.649.351.042.198.501.772.9227.4513.068.1110.339.281.022.248.461.722.8937.5713.218.3710.619.371.032.168.581.742.9847.3913.288.2110.589.491.012.188.611.762.9957.2913.318.2310.689.121.052.228.321.783.0067.5413.428.2910.699.321.022.188.291.752.96平均值/mg·g-17.4613.268.2410.599.321.032.208.461.752.96RSD/%1.400.901.051.261.311.441.351.561.241.47

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Results of sample recovery test

名稱(chēng)稱(chēng)樣量/g樣品相當(dāng)量/mg 加入對(duì)照品量/mg測(cè)定總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%3′-羥基葛根素0.985 67.352 65.8413.102 698.4698.370.760.982 77.330 95.8413.110 9 98.970.989 97.384 77.3014.584 798.630.990 67.389 97.3014.489 997.260.980 67.315 38.7616.005 399.200.999 17.453 38.7616.013 397.72葛根素0.985 613.069 110.4023.269 198.0898.480.780.982 713.030 610.4023.130 697.120.989 913.126 113.0026.026 199.230.990 613.135 413.0026.005 499.000.980 613.002 815.6028.402 898.720.999 113.248 115.6028.648 198.72葛根素芹菜糖苷0.985 68.121 36.4814.401 396.9197.87 1.160.982 78.097 46.4814.377 496.910.989 98.156 88.1016.056 897.530.990 68.162 58.1016.262 5100.000.980 68.080 19.7217.600 197.940.999 18.232 69.7217.752 697.943′-甲氧基葛根素0.985 610.437 58.4018.537 596.4398.041.050.982 710.406 88.4018.706 898.810.989 910.483 010.5020.698 397.290.990 610.490 510.5020.790 598.100.980 610.384 612.6022.784 698.410.999 110.580 512.6023.080 599.21大豆苷0.985 69.185 87.3616.345 897.2897.871.190.982 79.158 87.3616.218 895.920.989 99.225 99.2018.225 997.830.990 69.232 49.2018.332 498.910.980 69.139 211.0420.079 299.090.999 19.311 611.0420.151 698.19

表3(續(xù)) 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3(Continued) Results of sample recovery test

名稱(chēng)稱(chēng)樣量/g樣品相當(dāng)量/mg 加入對(duì)照品量/mg測(cè)定總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%染料木苷0.985 61.015 20.801.795 297.5098.080.940.982 71.012 20.801.800 298.500.989 91.019 61.002.005 698.600.990 61.020 31.002.000 398.000.980 61.010 01.202.201 199.260.999 11.029 11.202.188 996.65三七皂苷Rb10.985 62.168 31.763.908 398.8698.060.980.982 72.161 91.763.881 997.730.989 92.177 82.204.327 897.730.990 62.179 32.204.319 397.270.980 62.157 32.404.547 399.580.999 12.198 02.40 4.529 897.16人參皂苷Rg10.985 68.338 26.7215.018 299.4097.991.560.982 78.313 66.7215.011 699.670.989 98.374 68.4016.474 696.430.990 68.380 58.4016.480 596.430.980 68.295 910.0818.275 999.010.999 18.452 410.0818.232 497.02大豆苷元0.985 61.724 81.363.034 896.3297.101.260.982 71.719 71.363.039 797.060.989 91.732 31.703.412 398.820.990 61.733 61.703.403 698.240.980 61.716 12.043.686 196.570.999 11.748 42.043.698 495.59人參皂苷Rb10.985 62.917 42.325.137 495.6997.721.500.982 72.908 82.325.208 899.140.989 92.930 12.905.730 196.550.990 62.932 22.905.802 298.970.980 62.902 63.486.342 698.850.999 12.957 33.486.337 397.13

2.10樣品的含量測(cè)定 稱(chēng)取10批樣品，分別按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。各批樣品中3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷、三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、大豆苷元和人參皂苷Rb1的平均含量和RSD值見(jiàn)表4。

表4 10批次腦得生片中10種成分含量測(cè)定結(jié)果

Tab.4 Results of contents of 10 components in the 10 batches of Naodesheng Tablets

批號(hào)含量/mg·g-13′-羥基葛根素葛根素葛根素芹菜糖苷3′-甲氧基葛根素大豆苷染料木苷三七皂苷Rb1人參皂苷Rg1大豆苷元人參皂苷Rb1201705157.4613.268.2410.599.321.032.208.461.752.96201705167.4313.168.2110.709.221.012.218.421.712.90201705177.5613.248.3210.629.341.052.178.571.762.95201705187.3213.208.1410.539.511.042.198.521.742.94201705197.3013.328.2810.659.191.022.188.511.723.01201705207.5213.418.4910.779.331.062.248.391.772.92201705217.5113.388.2710.899.521.022.238.441.732.97201705227.4913.368.2610.379.361.042.188.401.693.03201705237.3513.458.3910.639.331.062.198.361.702.98201705247.3713.488.3210.609.351.032.268.331.722.99平均含量/mg·g-17.4313.338.2910.649.351.042.218.441.732.97RSD/%1.230.821.111.241.071.581.280.861.451.28

3 分析與討論

采用全波長(zhǎng)對(duì)腦得生片樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在250 nm處3′-羥基葛根素、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷和大豆苷元7種化合物與相鄰各峰分離度≥1.5，在203 nm處三七皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb13種化合物與相鄰各峰分離度≥1.5，故將250和203 nm作為HPLC定量波長(zhǎng)。鑒于本制劑為中藥復(fù)方制劑且工藝為水提物與原生藥粉混合入藥，各成分極性不同，恒定比例難以充分洗脫，因此采用梯度洗脫的方法。筆者曾選用不同型號(hào)不同規(guī)格的色譜柱，結(jié)果Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱較理想。對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)如甲醇-水、乙腈-水及乙腈-磷酸水溶液(磷酸水溶液質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，3.0，6.0和8.0 g·L-1)進(jìn)行了比較，結(jié)果乙腈-2.0 g·L-1磷酸水溶液系統(tǒng)最理想。對(duì)樣品溶液制備方法進(jìn)行比較，采用體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%和70%的乙醇和水作為溶劑；處理方法：不同時(shí)間超聲(5，15，30和45 min)或加熱回流(30，40和50 min)，結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇超聲30 min時(shí)較合適，主要原因是制劑工藝為水提物與全粉混合入藥，采用該方法較好地保證了不同極性成分的信息與含量；對(duì)不同柱溫與流速進(jìn)行比較，結(jié)果在柱溫為35 ℃與流速為0.8 mL·min-1時(shí)，系統(tǒng)適用性符合要求；色譜記錄時(shí)間在90 min之后，無(wú)色譜峰出現(xiàn)。故選擇柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL·min-1，記錄時(shí)間為90 min。

綜上所述，通過(guò)對(duì)10批腦得生片中10種活性成分定量分析，結(jié)果含量相對(duì)均一穩(wěn)定且專(zhuān)屬性強(qiáng)，說(shuō)明筆者建立的腦得生片HPLC定量方法操作簡(jiǎn)便，具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)勢(shì)。因此該方法可作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法，為進(jìn)一步研究體內(nèi)功效成分奠定了基礎(chǔ)。