不同產(chǎn)地知母藥材的含量測(cè)定及指紋圖譜研究

陳素娟，張艷秋，聶 靜，楊芊芊，高 歌，張 旗，韓晶晶，蔡程科，李 強(qiáng)*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，福州 350122)

知母始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，具有清熱瀉火和除煩止渴的功效[1]。知母主要分布于我國(guó)河北、遼寧、山西、安徽和內(nèi)蒙等地[2]，其中河北和安徽產(chǎn)量最大。據(jù)報(bào)道，知母中的主要化學(xué)成分包括雙苯吡喃酮類(lèi)、甾體皂苷類(lèi)和苯丙素類(lèi)等[3-4]，具有抗炎、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛和降血糖等作用，常用于外感熱病和高熱煩渴等癥的治療[5-6]。研究表明，知母中的芒果苷和新芒果苷是知母中抗炎、抗病毒的主要成分，屬于雙苯吡喃酮類(lèi)，也是降血糖和改善2型糖尿病癥狀的有效成分[7]。此外，知母中的甾體皂苷也具有重要的藥理活性，研究表明，知母皂苷BⅡ具有抗血栓、改善記憶功能障礙、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及治療老年癡呆等作用，在抗癌方面也有顯著的活性[8-9]。

2017年10月國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局提出了《中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定(征求意見(jiàn)稿)》[10]，旨在簡(jiǎn)化經(jīng)典名方復(fù)方制劑的申報(bào)要求。2018年4月國(guó)家中藥管理局頒布了《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》[11]，其中達(dá)原飲、升陷湯、二冬湯和玉女煎等多個(gè)經(jīng)典名方中包含中藥知母。意見(jiàn)稿中提出了經(jīng)典名方的研究需從中藥的原材料開(kāi)始定性定量，以全面控制原藥材的質(zhì)量[12]。

指紋圖譜技術(shù)是一種充分利用現(xiàn)代化科技手段達(dá)到最好表征中藥方劑體系特性的技術(shù)，也是反映中藥作用機(jī)制的最有效途徑，更是中藥質(zhì)量控制中最先進(jìn)的技術(shù)。它既能表達(dá)成品的質(zhì)量，用于工藝操作控制和原料輔料的質(zhì)量控制，又可從指紋圖譜中尋找工藝操作中的問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量控制。中藥材和復(fù)方制劑都極其復(fù)雜，必須采用多種技術(shù)來(lái)表征其質(zhì)量特性[13-17]。中藥指標(biāo)性成分含量測(cè)定和中藥指紋圖譜均能全面體現(xiàn)中藥材的整體質(zhì)量[18-19]。故本實(shí)驗(yàn)將從指標(biāo)性成分含量結(jié)合指紋圖譜對(duì)知母藥材的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為經(jīng)典名方復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(包含G1315B DAD檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，G1312A泵和G1313A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng))，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；BS124S型萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯公司)；KQ-5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZ-2BCIV型真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2試藥 乙腈，色譜純(批號(hào)173533，賽默飛世爾科技公司)；冰乙酸，分析純(批號(hào)20170831，北京化工廠)；乙醇，分析純(批號(hào)20160708，天津福晨化學(xué)試劑廠)。芒果苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.1%，批號(hào)111607-201704)，知母皂苷BⅡ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.5%，批號(hào)111839-201706)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。15批知母藥材均由河北神威藥業(yè)有限公司提供，見(jiàn)表1，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為百合科知母的干燥根莖。

表1 知母藥材信息

Tab.1 The information ofRhizomaAnemarrhenaesamples

編號(hào)產(chǎn)地批號(hào)S1亳州十九里ZM180311S2亳州十九里ZM180312S3亳州十九里ZM180313S4亳州十九里ZM180314S5亳州十九里ZM180315S6河北張家口ZM180321S7河北張家口ZM180322S8河北張家口ZM180323S9河北張家口ZM180324S10河北張家口ZM180325S11河北安國(guó)1708162S12河北安國(guó)1708163S13河北安國(guó)1708164S14河北安國(guó)1708165S15河北安國(guó)1708166

2 方法與結(jié)果

2.1知母藥材含量測(cè)定 根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部知母項(xiàng)下規(guī)定，對(duì)15批知母藥材中的指標(biāo)性成分芒果苷和知母皂苷BⅡ進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，15批知母藥材中的指標(biāo)性成分均符合藥典要求(藥典規(guī)定：芒果苷含量不得少于0.700%，知母皂苷BⅡ含量不得少于3.000%)。見(jiàn)表2。

表2 15批知母藥材含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 The results of content determination of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

編號(hào)芒果苷含量/%知母皂苷BⅡ含量/%S11.2815.841S21.3735.422S31.6874.577S41.4647.332S51.1705.114S61.2045.504S70.9025.377S80.8036.890S91.1805.878S101.1306.043S111.4923.844S121.2814.239S131.6554.061S141.5063.253S151.4053.402

2.2知母藥材指紋圖譜的建立

2.2.1色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-1 mL·L-1乙酸(B)梯度洗脫，梯度為：0～5 min，2%A→5%A；5～12 min，5%A→20%A；12～18 min，20%A→25%A；18～23 min，25%A；23～40 min，25%A→100%A；40～45 min，100%A。進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；波長(zhǎng)：258 nm。ELSD參數(shù)：漂移管溫度：105 ℃；氮?dú)饬魉伲?.6 L·min-1。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取各批次知母藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)0.5 g，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(400 W，40 kHz)處理30 min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取芒果苷和知母皂苷BⅡ?qū)φ掌愤m量，置于10 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度考察 取知母藥材粉末(編號(hào)S11)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和單峰面積占總峰面積10%以上的色譜峰的相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取知母藥材粉末(編號(hào)S11)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于配制后0，2，4，8，12，24，36和48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和單峰面積占總峰面積10%以上的色譜峰的相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，表明48 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次(編號(hào)S11)知母藥材粉末，按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和單峰面積占總峰面積10%以上的色譜峰的相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4指紋圖譜的建立 精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的15批次知母藥材供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜色譜峰信息。HPLC-UV指紋圖譜見(jiàn)圖1。生成的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖2，共有峰為4個(gè)。HPLC-ELSD指紋圖譜見(jiàn)圖3。生成的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖4，共有峰為7個(gè)。2張指紋圖譜共有峰用對(duì)照品對(duì)照共指認(rèn)了2個(gè)，分別是圖2中的3號(hào)峰為芒果苷和圖4中的4號(hào)峰為知母皂苷BⅡ。

圖1 15批知母藥材HPLC-UV指紋圖譜

Fig.1 HPLC-UV fingerprint of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

2.4.1參比峰的選擇 對(duì)照指紋圖譜中，以保留時(shí)間相對(duì)較穩(wěn)定且峰面積較大的芒果苷(3號(hào)峰)為知母藥材HPLC-UV-ELSD指紋圖譜的參照峰。

圖2 知母藥材HPLC-UV對(duì)照指紋圖譜

1～4.指紋特征峰；3.芒果苷。

Fig.2 The control fingerprint of HPLC-UV ofRhizomaAnemarrhenae

1-4.characteristic fingerprint peaks;3.mangiferin.

圖3 15批知母藥材HPLC-ELSD指紋圖譜

Fig.3 The HPLC-ELSD fingerprint of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

圖4 知母藥材HPLC-ELSD對(duì)照指紋圖譜

1～7.指紋特征峰；4.知母皂苷BⅡ。

Fig.4 The control fingerprint of HPLC-ELSD ofRhizomaAnemarrhenae

1-7.characteristic fingerprint peaks;4.saponins BⅡ.

2.4.2指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)軟件，進(jìn)行峰點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，運(yùn)用中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜。計(jì)算15批待測(cè)指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，見(jiàn)表3。

表3 15批知母藥材指紋圖譜相似度結(jié)果

Tab.3 Similarity results of fingerprints of 15 batches ofRhizomaAnemarrhenae

編號(hào)UV相似度ELSD相似度S10.9950.997S20.9930.994S30.9940.996S40.9940.994S50.9940.995S60.9580.957S70.9810.943S80.9690.927S90.9570.915S100.9780.962S110.9730.956S120.9980.968S130.9850.971S140.9750.965S150.9570.959

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV-ELSD指紋圖譜測(cè)定法從含量測(cè)定及指紋圖譜2個(gè)方面定性定量反映了藥材的整體質(zhì)量，較近幾年的研究[20-21]更全面。

3.1供試品制備方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了超聲提取法、萃取法和回流提取法3種供試品制備方法，結(jié)果3種方法無(wú)較大差異，由于超聲提取法耗時(shí)少且操作簡(jiǎn)單，最終選擇超聲提取法作為指紋圖譜供試品制備方法。考察了體積分?jǐn)?shù)分別為95%，75%和50%的乙醇、甲醇以及體積分?jǐn)?shù)分別為75%和50%的甲醇作為提取溶劑的差異。此外，還考察了不同超聲提取時(shí)間(30，60和90 min)對(duì)供試品制備的影響。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇作為提取溶劑時(shí)，色譜圖峰形較好，基線較平，而3個(gè)提取時(shí)間基本無(wú)差異，最終選擇體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇超聲提取30 min制備供試品。

3.2流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、乙腈-2 mL·L-1甲酸、乙腈-1 mL·L-1乙酸和乙腈-2 mL·L-1乙酸6種流動(dòng)相組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-1 mL·L-1乙酸作為流動(dòng)相時(shí)峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度較好，因此選擇乙腈-1 mL·L-1乙酸作為流動(dòng)相。

3.3條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了不同的柱溫(25，30，35 ℃)、不同的流速(0.8，0.9和1.0 mL·min-1)、不同的漂移管溫度(100，105和110 ℃)和不同的氮?dú)饬魉?2.3，2.6和2.8 L·min-1)的影響，經(jīng)過(guò)綜合分析色譜峰的峰形、分離度、基線平穩(wěn)程度、色譜柱和儀器的適用性以及操作簡(jiǎn)便性等多方面因素，最終選擇柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，漂移管溫度為105 ℃，氮?dú)饬魉贋?.6 L·min-1為知母藥材指紋圖譜分析的條件。

本實(shí)驗(yàn)初步建立了知母藥材的全面評(píng)價(jià)模式，該方法簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好，可為含有中藥知母的經(jīng)典名方復(fù)方制劑的研究提供參考。