綠尾虹雉（Lophophorus lhuysii）Toll樣受體5基因的克隆和適應性進化分析

周 明，李 彪，歐陽菠，鐘 赟，楊建東

（四川農業大學動物科技學院，成都 611130）

綠尾虹雉（Lophophorus lhuysii），隸屬于雞形目（Galliformes）雉科（Phasianidae），為我國特有的大型高山雉類，主要分布在四川西部海拔3 000～4 900 m的山區高山針葉林上緣及林線以上高山灌叢草甸，并邊緣性地分布于甘肅南部、青海東南部、西藏東部及云南西北部等地[1-2]。 由于綠尾虹雉分布區域狹窄和數量稀少，因此已被列為國家I 級重點保護瀕危野生鳥類，IUCN 和CITES 分別將其列為易危物種（vulnerable，VU）和附錄I 物種，Chen Y.H.等[3]在對中國大陸特有鳥類保護優先度的研究中將綠尾虹雉列為最優先保護的五種鳥類之一。目前，關于綠尾虹雉的研究多集中在繁殖生態[4-5]、棲息地選擇[6]、時間分配[7-9]、叫聲聲譜分析[10-11]、種群密度[12]、血液生理生化指標[13-14]及行為節律[7-8]等生態學和保護生物學方面。

Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）基因作為一個古老的先天免疫介導基因，最早于果蠅胚胎發育的研究中被發現，可將其分為病毒型TLRs 和非病毒型TLRs 兩大類[15]。作為中間介導的模式識別分子，Toll 樣受體基因主要通過識別病原體進化過程中的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），在先天免疫和適應性免疫過程中起著橋梁作用[16，17]。 目前，已有的研究發現鳥類中分布有10 個TLR 基因（TLR1A，TLR1B，TLR2A，TLR2B，TLR3，TLR4，TLR5，TLR7，TLR15 和TLR21）[18-19]。TLRs 基因結構屬于典型的Ⅰ型跨膜結構蛋白，包括胞外的富亮氨酸重復序列區（leucine-rich repeats，LRRs）、 跨膜區和與白介素受體高度同源的胞內區（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）[20-21]。

TLR5 基因作為Toll 樣受體家族基因中的重要成員，在動物防御細菌病原體中起到重要的作用[22]。研究發現，TLR5 基因胞外區的LRR 區域能夠與革蘭氏陰性菌的鞭毛蛋白直接作用而激活TLR5 基因依賴性信號傳導途徑來促發一系列免疫應答反應[23-24]。 TLR5 基因信號轉導途徑的激活，能夠激活下游的核轉錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NFκB），進而促使各種免疫相關基因的表達[25-26]。 由于TLR5 基因的缺失，導致小鼠缺乏對細菌鞭毛蛋白的識別，從而更容易患上肺部炎癥反應和感染泌尿道大腸桿菌疾病[25]。鵝的TLR5 基因能夠識別細菌的鞭毛蛋白，并且誘導HEK293 細胞中NF-κB 因子表達的上調[27]。TLR5 R392*突變蛋白受體能夠嚴重損害TLR5 基因介導的信號傳導途徑，因而促使受體更容易感染肺炎[28]。雖然早在2005年就成功克隆出了鳥類的TLR5 基因，但與人TLR5 基因相比，禽類TLR5基因對鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白具有更強的促炎反應[29]。此外，缺乏鞭毛蛋白的鼠傷寒沙門氏菌對禽類的感染能力顯著增強[30]。因此，大量的研究表明TLR5基因在哺乳動物、 鵝和雞的先天免疫反應中起到重要的作用，其功能狀態很可能與宿主對細菌感染的易感性至關重要。

然而，有關綠尾虹雉分子方面研究多見于利用線粒體基因探討其系統進化關系[31-32]，而對分子免疫以及Toll 樣受體的研究國內外還未見報道。因此，本研究通過對綠尾虹雉TLR5 基因進行克隆和進化分析，以期了解該基因的結構功能和適應性進化，為綠尾虹雉疾病防控相關研究提供基礎數據支撐。

1 材料和方法

1.1 綠尾虹雉基因組總DNA 的提取

試驗所用綠尾虹雉樣品保存于四川農業大學野生動物保護實驗室。 總DNA 提取按照常規酚/氯仿抽提法提取[33]，提取的DNA 用ND-2000 超微量核酸蛋白測定儀（Nanodrop，美國）檢測其濃度，最后DNA -20 ℃保存備用。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank 中錄入的原雞（登錄號：FJ915551.1）和鴻雁（登錄號：XM_013173959.1）TLR5 基因序列，利用primer5.0 在TLR5 基因編碼區序列設計特異性引物，SF1（上游）：5′-AGATGATACCTCGTAGACT-3′，SR1（下游）：5′-AAAGCGAAATGATAAATA-3′；SF2（上游）：5′-GTTTTTCCACGAAGCCTAATA-3′，SR2（下游）：5′-AAAGCCAGCAACCCATCAA-3′；av-TLR1LAF and avTLR1LAR[34]，并送由北京擎科新業生物技術有限公司（成都）合成。

1.3 TLR5 基因的PCR 擴增

PCR 擴增模板為綠尾虹雉基因組DNA，PCR 反應體系：1.5 μL（121 ng/μL）模板DNA、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，PCR 預混液（北京擎科）22.5 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，51-52.5 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共循環35次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后取2 μL PCR 擴增產物，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳10 min（100V，80A），于凝膠成像系統中檢測擴增結果。

1.4 PCR 產物克隆及序列測序

用Axygen 凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，將純化后的產物與pEASY-Blunt Zero 載體（北京全式金生物技術有限公司）于室溫連接15 min（V純化產物∶V載體=4∶1），將連接產物轉化進DH5α 感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司），并于37 ℃恒溫搖床培養復蘇1 h； 然后將菌液在含有100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體培養基上接種，37 ℃過夜培養（約12 h）；挑選單菌落于LB 液體培養基中培養，37℃恒溫搖床200 r/min，6～8 h，挑選6 個菌液PCR 鑒定為陽性的樣品送往北京擎科新業生物技術有限公司（成都）進行測序。

1.5 綠尾虹雉TLR5 的分子特征與同源性分析

采用Chromosoma1.62，SeqMan 等序列比對軟件對所測的TLR5 基因序列進行人工校對、編輯。 利用NCBI 網站的ORF Finder 工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorffgorf.htm1）對綠尾虹雉TLR5 基因開放閱讀框進行預測。 利用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/） 在線分析軟件對其功能結構域進行預測。 利用MEGA 6.0 軟件對綠尾虹雉TLR5 基因的序列特征、堿基組成、氨基酸組成、突變位點、簡約信息位點等進行統計分析。

1.6 綠尾虹雉TLR5 基因的系統發生分析

基于MEGA 6 和RaxML 7 軟件，采用鄰近法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）構建綠尾虹雉TLR5 基因的系統發生樹。采用MEGA 6 軟件構建NJ 樹，以Kimura 雙參數模型（Kimura 2-parameter）為核苷酸替代模型，分支置信度采用自展（bootstrap）檢驗法進行評價，自展檢驗重復次數為1 000 次；ML 樹構建，以Modelgenerator_v_851 預測最佳核苷酸模型，根據預測模型及參數采用RaxML 7 軟件構建ML 樹，自展檢驗重復次數為1 000 次。 其余9 種鳥類TLR5 基因登錄號為FJ915551.1（原雞，Gallus gallus）、JF767220.1（雉雞，Phasianus colchicus）、HQ436463.1（火雞，Meleagris gallopavo）、JF767221.1（珠雞，Guinea fowl）、XM_013173959.1（鴻雁，Anser cygnoides）、JN641303.1（灰雁，Anser anser）、XM_009275754.1（帝企鵝，Aptenodytes forsteri）、XM_009637106.1（小白鷺，Egretta garzetta）、XM_010074631.1（沙雞，Pterocles gutturalis）。

1.7 綠尾虹雉TLR5 適應性進化分析

利用MEGA 6.0 軟件中的Pamilo-Bianchi-Li's方法對綠尾虹雉與其余9 種鳥類TLR5 基因蛋白質編碼區序列的非同義替換數（non-synonymous substitutions，dN）和同義替換數（synonymous substitutions，dS）進行計算，并基于單尾Z-檢驗檢測dN/ dS（ω）偏離中性選擇的期望值。TLR5 基因的適應性進化利用PAML 4 軟件包中的Codeml 程序中的位點-特異模型（site-specific）進行分析。 采用3 對統計模型M0（one ratio）vs M3（discrete）、M1a（nearly neutral）vs M2a（positive selection）和M7（beta）vs M8（beta+ω），根據兩兩成對模型最大似然值對數差的兩倍（2Δl）與自由度的χ2 分布進行比較，使用保守貝葉斯經驗值（bayes empirical bayes，BEB）進行后驗概率檢測[35-36]。

2 結果與分析

2.1 綠尾虹雉TLR5 基因的分子特征

通過PCR 克隆方法獲得綠尾虹雉TLR5 基因編碼區序列，GenBank 登錄號為MH908966。 如圖1所示，對綠尾虹雉TLR5 基因編碼區開放閱讀框分析表明其蛋白編碼區長度為2 583 bp，共編碼860個氨基酸。 4 種堿基的平均組成比例分別為T（31.32%）、C（20.02%）、A（30.39%）和G（18.27%），A+T 含量為61.71%，高于C+G 含量為38.29%；綠尾虹雉TLR5 蛋白含有20 種常見氨基酸（圖1），以亮氨酸數量最多，占總數的15.47%（113/860），色氨酸數量最少，占總數的1.28%（11/860）。 功能結構域預測表明（圖2），綠尾虹雉TLR5 基因為典型的Ⅰ型跨膜結構，主要由胞外集中的3 個LRR 結構域和LRR_CT 結構、跨膜區和胞內的TIR 結構域組成。

2.2 綠尾虹雉TLR5 基因編碼區序列同源性分析

采用MEGA 6.0 對綠尾虹雉與原雞等9 種鳥類TLR5 基因的核苷酸和氨基酸序列進行同源性比對（表1），核苷酸比對結果顯示綠尾虹雉與雉雞、原雞、 火雞和珠雞的同源性較高，分別達到97.75%、95.54%、95.39%和94.18%，與鴻雁、灰雁、帝企鵝和沙雞的同源性次之，分別為86.71%、86.66%、86.70%和86.04%；與小白鷺的同源性最低（85.17%）。 氨基酸比對結果顯示綠尾虹雉與雉雞、原雞、火雞和珠雞的同源性較高，分別達到96.86%、94.07%、93.83%和92.21%，與沙雞、小白鷺和帝企鵝的同源性次之，分別為83.95%、83.49%和83.37%；與鴻雁和灰雁的同源性最低（82.54%和82.31%）。

圖2 綠尾虹雉TLR5 基因蛋白結構域分析結果Figure 2 Protein domains prediction of TLR5 gene of Chinese monal

對TLR5 基因CDS 區核苷酸序列（2 583 bp）進行比對，如表2所示，共檢測出680 個核苷酸變異位點，占總位點的26.33%。 其中，單核苷酸變異位點288 個，占總變異位點的42.35%，占總位點的11.15%；簡約信息位點392 個，占變異位點總數的57.65%，占總位點的15.18%。 對氨基酸序列（860 aa）進行比對（表2），共檢測出276 個氨基酸變異位點，占總氨基酸數的32.09%。 其中，單個氨基酸變異位點90 個，占變異位點的32.61%，占總氨基酸位點的10.45%； 簡約信息位點186 個，占變異位點的67.39%，占總氨基酸位點的21.60%。 進一步對綠尾虹雉TLR5 基因編碼蛋白的胞外區、跨膜區和胞內區核苷酸和氨基酸的變異位點進行了統計，結果顯示核苷酸變異位點數量占總核苷酸數量的比例分別為20.94%、0.93%、4.45%，氨基酸變異位點數總氨基酸殘基的比例分別位25.90%、1.16%、5.00%（表2）。

表1 不同物種間TLR5 基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比對Table 1 Homology comparison of TLR5 gene sequences between Chinese monal and 9 other birds %

表2 綠尾虹雉TLR5 基因編碼區不同區域DNA 序列（DNA）及其氨基酸序列（AA）的總長度及變異位點數Table 2 Toal length and variable sites of different coding regions in Chinese monal TLR5 DNA and AA sequence

2.3 綠尾虹雉TLR5 基因的系統發育分析

為了更好的揭示綠尾虹雉TLR5 基因的系統進化關系，采用鄰近法和最大似然法構建NJ 樹和ML樹（圖3），兩種樹的拓撲結構完全一致，各節點支持率都在90%以上，為綠尾虹雉的系統發育提供了一種可能的參考。由圖2可以看出，系統發育樹由3 個主要分支組成。綠尾虹雉首先與雉科的雉雞、火雞和原雞聚為一支，再與珠雞科的珠雞聚在一起形成一個雞形目亞組；來自鸛形目的小白鷺、企鵝目的帝企鵝和沙雞目的沙雞聚為一個亞組； 雁形目的鴻雁與灰雁單獨聚為一個亞組。 因此，綠尾虹雉與雉雞、火雞和原雞的親緣關系最近，與涉禽和游禽類鳥類的關系較遠。

2.4 TLR5 基因的適應性進化分析

2.4.1 TLR5 基因編碼區進化模式分析

圖3 綠尾虹雉與其他9 個鳥類TLR5 基因構建的系統進化Figure 3 Phylogenetic tree of TLR5 gene sequences of Chinese monal and 9 others birds

圖4 綠尾虹雉TLR5 基因和其他鳥類TLR5 基因不同區域非同義替換（dN）和同義替換（dS）Figure 4 Non-synonymous substitution （dN） and synonymous substitution （dS） of different regions of the Chinese monal TLR5 gene and other birds.

TLR5 基因不同區域非同義替換（dN）、同義替換（dS）和dN/dS 相對頻率見圖4，綠尾虹雉TLR5 基因完整編碼區序列同其他9 種鳥類的核苷酸替換結果均表現出dN＜dS，即（dN/dS）ω＜1。 顯著性檢驗顯示，與雉雞達到顯著水平（P＜0.05），同其余8 種達到了極顯著的水平（P＜0.01）。進一步對胞外編碼區、跨膜編碼區和胞內編碼區分別分析時，如圖4所示，發現3 個區域均表現出（dN＜dS）ω＜1。對于跨膜區編碼區，雖然（dN＜dS）ω＜1，但是顯著性檢驗結果均表現出不顯著，說明在跨膜區編碼區處受到純進化選擇的壓力相對較弱。 對于胞內編碼區，綠尾虹雉同鴻雁、灰雁、小白鷺、原雞、帝企鵝、沙雞和珠雞的顯著性檢驗為極顯著（P＜0.01），與雉雞達到顯著水平（P＜0.05），而與火雞則表現出不顯著（P＞0.05），說明胞內編碼區受到了強烈的純凈化選擇（purification selection）。 對于胞外編碼區，綠尾虹雉與小白鷺、帝企鵝和沙雞的顯著性檢驗為極顯著（P＜0.01），與鴻雁、火雞和珠雞達到顯著水平（P＜0.05），與灰雁、原雞和雉雞之間則不顯著（P＞0.05）。 因此，3 個區域卻展現出了不同的進化選擇模式。

2.4.2 TLR5 基因編碼區選擇壓力分析

從系統發育樹的拓撲結構可以預示出TLR5 基因在各枝上的進化速率可能不同（圖3），dN/dS 分析也表明TLR5 基因受到了強烈的純進化選擇，但考慮到其高度分化的生態環境是否存在特異位點。 因此，我們選用PAML 軟件中的Codeml 程序的位點-特異模型檢測TLR5 基因編碼區所經歷的選擇壓力。

通過對模型M0 和M3 的比較來檢驗位點間的變異程度，如表3所示，它們的2 倍似然值[2Δ（lnL）=165.906 6]，極顯著大于df=4、P=0.01 時χ2分布的臨界值，說明TLR5 基因在所檢測的位點間的進化速率變異大，然而在模型M3 中未檢測出正選擇位點。 M1a 和M2a，M7 和M8 兩對模型的比較用于檢測正選擇位點，模型M2a 估計正選擇位點的ω2=5.437 92，模型M8 的ω=1.766 93 均大于1，預示著TLR5 基因很可能存在正選擇位點。 在對模型M1a和M2a 進行比較發現，他們2Δ（lnL）=4.704 3，df=2、P＞0.05，說明模型M2a 不顯著優于模型M1a，因此不能拒絕模型M1a，同時在模型M2a 中也為檢測出正選擇位點。在對模型M7 和M8 進行比較時，他們2Δ（lnL）=9.524 0，df=2、P＜0.01，說明模型M8 極顯著優于模型M7，因此拒絕模型M7，選擇模型M8。 模型M8 估算出TLR5 基因在95%水平受到正選擇位點（ω＞1）的可能性有8.60%。模型M8 共檢測出3 個受到正選擇位點的氨基酸，對應綠尾虹雉TLR5 編碼區氨基酸位置分別為263F、280K 和645I。

3 討論

TLRs 是固有免疫系統的重要組成部分，在觸發下游免疫級聯信號，啟動對入侵病原體的免疫反應中起到重要的作用[37]。TLR5 基因在哺乳動物固有免疫中發揮著重要的作用[22-24]，近年來在雞和鵝TLR5基因的研究中表明，家禽TLR5 基因的同源蛋白在識別鞭毛蛋白的免疫應答反應中有著相似的作用[27]。然而，在對于野生鳥類TLR5 基因的結構、生物學功能的研究知之甚少。

表3 TLR5 基因在鳥類中位點特異性模型檢驗Table 3 The test of selective pressure on TLR5 gene in birds using site-specific models in PAML

TLRs 基因主要由胞外富含亮氨酸的LRR 區域、跨膜區和胞內TIR 區域組成[20-21]。 我們的研究也表明綠尾虹雉TLR5 基因也是類似結構，在胞外區的第90aa～190aa、300aa～400aa 和500aa～560aa 間存在3 個集中分布的LRR 區域和1 個LRR_TYP 結構域。 然而，鴻雁和灰雁則分布有較多的LRR_TYP 結構域[27]，在火雞胞外區卻沒有LRR_TYP 結構域[29]。這表明TLR5 基因存在著物種特異性，而這種物種間的特異性適應可能反映了特定宿主與相關微生物的協同進化的關系[38]。與低海拔的火雞、鴻雁和灰雁相比，綠尾虹雉主要分布在高海拔地區的大型陸禽，由于其生活環境的差異可能接觸了不同的病菌，使TLR5 分子在識別病原體的過程中發生了適應性的進化[34，39]。

同源性分析表明不同物種TLR5 基因核苷酸和氨基酸序列有著較高的保守性。 在進一步對不同區域變異位點分布的研究發現，胞外區變異位點數占總變異位點數比例最大，核苷酸和氨基酸的變異比例分別為79.56%和80.10%，并且大多分布在LRR結構域上。 Ruan W.等[40]在對10 種家雞TLR5 基因多態性研究中發現所有氨基酸多態位點均分布在胞外區，其中有60%分布在LRR 結構域上的結果相似。在家鴿的研究中也發現，家鴿TLR5 基因的多態位點大部分分布在胞外區[41]。已有的研究表明，胞外區的LRR 結構域主要參與配體的識別和信號傳導，能夠識別特定的PAMP 分子，從而激活天然免疫反應途徑[42]。 因此，我們可以推測綠尾虹雉TLR5 基因胞外區LRR 結構域很可能也是潛在的與病原微生物相結合的區域。

進一步對綠尾虹雉與另外9 種鳥類TLR5 基因蛋白編碼區位點的非同義替換（dN）和同義替換（dS）分析顯示，綠尾虹雉TLR5 基因與鴻雁和火雞等9中鳥類之間存在這強烈的功能束縛，顯示出強烈的純進化選擇。然而，在胞外和胞內編碼區表現出極顯著的水平（ω＜1），而在跨膜區著表現出不顯著（ω＜1），這與在家雞和家鴿的研究結果相似[40-41]。 考慮到dN/dS在種群內部變異位點識別的不敏感性[22，34，42]，我們利用PAML 軟件包中Codeml 程序的位點-特異模型檢測TLR5 基因編碼區各個位點所經歷的選擇壓力。 選擇壓力分析中共檢測到3 個正選擇位點（263F，280K 和645I），進一步分析發現其中263F和645I 兩個位點同時出現在雉科鳥類和鴨科鳥類中，我們推測很可能是在識別病原微生物時發生了趨同的適應性進化[34，39]。 我們的研究發現280K 位點只出現在綠尾虹雉中，這可能與綠尾虹雉適應高海拔環境下特異病原微生物有關[34，37]。這一結果揭示了鳥類TLR5 基因在不同鳥類中發生了適應性進化，為今后開展點突變的功能驗證提供了理論指導。

4 結論

本研究成功對綠尾虹雉TLR5 基因進行了克隆和適應性進化進行了分析。 各物種間TLR5 基因有著較高的同源性，通過功能結構域的對比分析發現，胞外區LRR 存在著種間特異性差異。 各物種dN/dS分析發現，TLR5 基因編碼區表現出較強的純凈化選擇，利用PAML 中位點-特異模型共檢測出TLR5 基因中有3 個氨基酸（263F，280K 和645I）位點受到正選擇作用，并且這3 個位點均分布在胞外編碼區。研究結果為進一步理解和研究天然受體TLRs 在綠尾虹雉等野生鳥類的天然免疫的分子機制、 適應性進化以及抗病育種提供理論基礎。同時，研究也填補了綠尾虹雉在Toll 樣受體基因研究方面的空白，為進一步開展綠尾虹雉相關功能基因的表達調控、 遺傳資源保護和分子適應性進化研究奠定了科學依據。