板栗過氧化氫酶基因CmCAT的克隆與原核表達

劉裕峰，朱天輝，劉應高，譙天敏，李姝江，龍旭梅，韓 珊

（四川農業大學林學院，成都 611130）

首次發現動植物組織能夠分解過氧化氫產生氧氣可追溯到1811年，后被發現可能是某種酶起作用，直到1901年，該酶被命名為過氧化氫酶（hudrogen peroxidase），又名觸酶（catalase，CAT）[1]。現已發現在動物、植物及微生物體內均含有大量的CAT。病原菌的入侵會打破超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）等活性氧類（reactive oxygen species，ROS）物質的動態平衡，導致活性氧物質在植物體內大量積累，長時間的積累而得不到有效的清除，會損傷植物細胞膜系統，破壞蛋白質功能，嚴重時導致植株死亡[2]。CAT 作為植物體內主要的抗氧化酶之一，它能夠催化植物光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪酸氧化等過程中產生的H2O2生成O2和H2O[3]。有報道稱[4]，一分子CAT 每分鐘能將大約6×106個H2O2分子轉化成H2O 和O2。因此，CAT 對H2O2的清除具有較高的特異性，并且在去除H2O2過量中起關鍵作用[5]，使得植物不受傷害。

大量研究表明，CAT 與植物的抗病性存在著緊密的聯系。Pei Z.M.等[6]研究發現，缺失CAT 基因的煙草體內H2O2含量增加，導致細胞死亡；Jiang M.等[7]發現，植物的CAT 活性能夠被水楊酸抗病因子抑制，導致過多的ROS 產生，進而引起植物系統性的防御反應；病原菌浸染植物的初期階段，CAT 催化H2O2生成O2，觸發苯甲酸生成水楊酸，導致系統性防衛反應的發生[8]；轉玉米CAT2 基因的煙草遭受病原菌侵染后，誘發嚴重的超敏反應，進而有效地控制細菌的進一步感染[9]；轉基因煙草植株體內酵母CAT1 基因的過量表達，能夠提高轉基因植株的抗病毒侵染能力[10]。

植物CAT 基因家族由多個基因編碼，其表達受病原、溫度、光照、干旱等多種因子的調控[11]。目前，已從火龍果[12]、人參[13]、甘薯[14]、南瓜[15]、水稻[16]、壇紫菜[17]等多種植物中克隆獲得CAT 基因并進行相關分析。但目前關于板栗CAT 基因的相關研究較少，異源表達方面的研究尚屬空白。本研究在板栗轉錄組學研究[18]的基礎上，利用RT-PCR 技術克隆獲得板栗CAT 基因全長cDNA 序列，并進行了相關生物信息學分析，同時構建pET28a-CmCAT 原核表達載體，在大腸桿菌中進行了融合表達，旨在了解其基因結構和功能，為進一步研究板栗抗病的分子機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試板栗品種為“石豐”，種植于四川農業大學林學院崇州基地；植物RNA 提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；PCR 反轉錄試劑盒、pMD19-T 載體購自大連TaKaRa 公司；DNA 純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；表達載體pET-28a 由四川農業大學林學院林木病理學實驗室提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶EcoRI、XhoI、T4DNA 連接酶購自NEB（北京）有限公司；其他試劑為進口或國產分析純。

1.2 總RNA 的提取與cDNA 的合成

以板栗幼葉作為RNA 提取材料，使用植物多糖多酚RNA 提取試劑盒（北京華越洋生物）提取總RNA。提取的總RNA 經BioMate 3S（BioMate 3S，Thermo Scientific）及1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和完整性。cDNA 第一鏈的合成使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TaKaRa，大連），具體操作步驟參照說明書進行。合成的cDNA保存于-80 ℃，用于后續試驗。

1.3 CmCAT 基因的克隆

根據NCBI 數據庫中已公布的其他植物CAT基因核苷酸序列，將其與板栗基因組數據庫（http：//www.hardwoodgenomics.org/）進行同源比對，尋找并分析板栗CAT 基因EST 序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設計一對特異性引物CmCAT-F：5'-ATG GATCCCTACAAGTACCG-3'，CmCAT-R：5'- TCA CATTGTTGGCCTCAC-3'。以反轉錄的板栗cDNA為模板，進行PCR 擴增，反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃終延伸7 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行純化回收，回收片段連接pMD19-T 載體并轉化E.coli DH5α，于氨芐青霉素（ampicillin，Amp）培養基上進行藍白斑篩選，挑取白色單克隆菌落進行PCR 鑒定，將菌落PCR 檢測的陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。

1.4 CmCAT 基因序列的生物信息學分析

通過軟件DNAMAN6.0 查找序列的ORF，并將其翻譯為氨基酸序列；通過在線NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast 進行核苷酸序列和氨基酸序列相似性分析；應用ClustalX1.81 和ESPript3.0軟件對其編碼蛋白進行多重對比分析；運用在線蛋白分析工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）對其編碼蛋白的理化性質進行預測分析；利用工具ScanProsite（http：//prosite.expasy.org/scanprosite）對其編碼蛋白的功能位點及功能域進行預測分析；利用軟件MEGA6.05 進行系統進化樹分析。

1.5 原核表達載體的構建及鑒定

根據前期克隆獲得的CmCAT 基因CDS 序列，設計一對含酶切位點的引物CmCAT-EcoRI-F：5'-CGGAATTCATGGATCCCTACAAGTACCG-3'（下劃線為EcoRI 酶切位點），CmCAT-XhoI-R：5'-CCGC TCGAGTCACATTGTTGGCCTCAC-3'（下劃線為XhoI酶切位點）。以pMD19-T-CmCAT 質粒為模板，進行PCR 擴增，擴增條件同1.3。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行純化回收。回收產物與pET-28a 載體質粒均進行EcoRI 和XhoI 雙酶切，酶切產物純化回收后，使用T4 DNA 連接酶16 ℃連接12 h。連接產物轉入大腸桿菌BL21（DE3），于卡那霉素（kanamycin，Kan）培養基上進行抗性篩選，挑取單個菌落于LB 液體培養基擴增培養后進行PCR鑒定，提取鑒定正確的菌液質粒，對質粒進行EcoRI和XhoI 雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。

1.6 重組質粒的誘導表達及SDS-PAGE 檢測

將測序正確的重組質粒轉化表達宿主菌BL21（DE3）。挑取含有pET28a-CmCAT 重組質粒的BL21（DE3）單菌落，接種于含有Kan（50 μg/mL）LB液體培養基中，37 ℃（200 r/min）過夜振蕩培養。次日按1∶100 的接種量進行擴增培養，當菌液OD600值約為0.6～0.8 時，分別進行不同條件的誘導。首先利用不同濃度IPTG（終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）誘導3 h，收取1 mL 菌液進行SDS-PAGE檢測；以上述最優IPTG 濃度進行誘導時間（1、2、3、4、5、6 h）的優化。

最后以最優IPTG 濃度和最優誘導時間進行不同溫度（25 ℃、30 ℃、37 ℃）的誘導優化并進行誘導蛋白的可溶性分析。收集1 mL 菌液于1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心10 min，取沉淀，加入100 μL PBS（pH7.4）懸浮菌體，12 000 r/min 離心1 min，收集菌體，再次加入60 μL PBS（pH 值7.4）懸浮菌體后，4 ℃超生破碎，12 000 r/min 離心10 min。收集超聲破碎后的上清液和沉淀（加入60 μL 8 mol/L尿素重懸，4 ℃螯合30 min）。分別加入4×蛋白上樣緩沖液20 μL 混勻，煮沸10 min，冰上冷卻后，12 000 r/min 離心10 min，取10 μL 上清進行SDSPAGE（5%濃縮膠，12%分離膠）電泳檢測。所有的SDS-PAGE 電泳檢測均以pET28a-BL21（DE3）以及未誘導的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）作為對照。

2 結果與分析

2.1 板栗CmCAT 基因全長cDNA 的擴增與克隆

使用CmCAT-F 和CmCAT-R 特異性引物，對CmCAT 基因完整閱讀框（ORF）進行RT-PCR 擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現一條約為1 500 bp 的單一條帶，通過pMD19-T 克隆測序，發現獲得了長度為1 479 bp 的CmCAT 基因片段（見圖1）。

圖1 CmCAT 基因PCR 擴增電泳圖Figure 1 The electrophoresis of PCR product of CmCAT gene

2.2 板栗CmCAT 基因的核苷酸序列分析

板栗CmCAT 基因全長cDNA 序列為1 479 bp，通過ORF Finder 在線軟件進行分析，發現該序列為一個完整的閱讀框，無5'非編碼區和3'非編碼區，編碼492 個氨基酸（見圖2），將該基因cDNA 序列提交NCBI 數據庫，注冊登錄號：KY312851。CmCAT基因核苷酸序列在GenBank 中進行序列相似性對比，結果顯示該序列與核桃（Juglans regia，XM_01 8980866.1）CAT 基因序列一致性最高，為85%，與毛果楊（Populus trichocarpa，XM_002301884.1）、茶（Camellia sinensis、KR819178.1）、蘿卜（Raphanus sativus，AF031318.2）等多種植物CAT 基因序列一致性均在77%以上。表明克隆獲得的CmCAT 基因屬于板栗過氧化氫酶基因家族成員之一。

2.3 板栗CmCAT 蛋白的氨基酸序列分析

圖2 CmCAT 基因cDNA 序列及其所推導的氨基酸序列Figure 2 cDNA sequence of CmCAT gene and its deduced amino acid sequence

利用ExPASy ProtParam tool 對CmCAT 蛋白質序列進行相關信息分析，預測CmCAT 蛋白分子質量為56.883 kDa；理論pI 為5.83；在組成CmCAT 蛋白的所有氨基酸中，精氨酸（Arg）為使用頻率最高的氨基酸，占總氨基酸量的8.1%，半胱氨酸（Cys）為使用頻率最低的氨基酸，占總氨基酸量的1.0%；其含有61個負電性氨基酸殘基（Asp + Glu），59 個正電性氨基酸殘基（Arg + Lys），分子式為C2550H3865N719O736S16；預測不穩定指數為36.20，屬于穩定性蛋白；脂肪族氨基酸指數69.15；總平均疏水指數-0.586，屬于親水性蛋白。使用ClustalX1.81 與ESPript3.0 軟件并結合BlastP 對CmCAT 蛋白序列進行多序列相似性分析，結果顯示（見圖3），CmCAT 蛋白序列與蔓花生（Arachis duranensis，XP_015934030.1）等多種植物CAT 蛋白序列同源性達到82%以上。通過Blastp 和ScanProsite 工具對CmCAT 蛋白功能域進行分析，均發現其含有catalase 保守結構域，位于序列第14-492 位氨基酸之間。可見，CmCAT 屬于CAT 蛋白家族成員之一。通過在線工具Motif 發現，CmCAT 蛋白還具有2 個重要的功能位點，分別是過氧化氫酶近端活性位點（catalase proximal active site signature），位于第54-70 位氨基酸之間，序列為FERERIPERVVHARGAS；過氧化物酶近血紅素位點（catalase proximal heme-ligand signature），位于第344-352 位氨基酸之間，序列為RIFAYGDTQ（見圖2）。進一步說明CAT 蛋白在進化過程中是較為保守的，CmCAT 蛋白與其他植物的CAT 蛋白結構和功能是較為相似的。

2.4 板栗CmCAT 蛋白的進化分析

為了解不同植物CAT 間的進化關系，從NCBI數據庫下載了23 個物種CAT 氨基酸序列，利用MEGA6.05 軟件，采用鄰接法，重復檢測1 000 次，構建其與CmCAT 氨基酸序列之間的進化關系（見圖4）。系統進化樹分析結果表明，24 個物種CAT 聚集為兩大類群，草本植物CAT 聚為一簇，木本植物CAT 聚為一簇，符合植物的生物進化規律。板栗CmCAT 與核桃JrCAT 同為一個分支，親緣關系最近，推測它們可能由同一個祖先進化而來。其次，與薔薇科（Rosaceae）植物親緣關系較近，而板栗CmCAT 與葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜、黃瓜、絲瓜等植物親緣關系較遠。

圖3 CmCAT 與其他植物CAT 蛋白質序列多重對比Figure 3 Sequence multialignment of the deduced CmCAT protein with other plant CAT proteins

圖4 Neighbor-joining（NJ）方法構建CmCAT 蛋白與其他植物CAT 蛋白的系統進化樹Figure 4 Neighbor-joining （NJ） method to build CmCAT protein and other plant CAT protein phylogenetic tree

2.5 重組表達載體的構建

以pMD19-T-CmCAT 質粒為模板，使用CmCAT-EcoRI-F/CmCAT-XhoI-R 引物擴增獲得帶酶切位點的CmCAT 基因片段，將PCR 產物純化回收后與pET-28a 載體分別進行EcoRI/XhoI 雙酶切，分別回收目的片段與載體酶切產物并進行連接轉化，挑取單菌落進行PCR 鑒定（見圖5），條帶與預期大小一致；提取PCR 鑒定正確的陽性菌液質粒，進行雙酶切驗證（見圖6），獲得預期大小的酶切片段。將驗證正確的陽性重組質粒送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定，測序結果比對發現，CmCAT 基因片段與pET-28a 載體成功連接，表明pET28a-CmCAT 重組表達載體構建成功。

2.6 板栗CmCAT 蛋白的原核表達

挑取pET28a-CmCAT-BL21（DE3）單菌落過夜培養作為母液。在37 ℃下進行不同IPTG 濃度誘導表達6 h，以未誘導的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）、pET28a-BL21（DE3）以及誘導的pET28a-BL21（DE3）（IPTG 終濃度為0.6 mmol/L，誘導3 h）空載體作為對照。結果表明，對照組無目的蛋白表達，實驗組在各IPTG 濃度下均能誘導大量表達，組間表達量并無多大差異，分子量約為60 kDa，與預期大小一致（見圖7）。因此，以終濃度0.2 mmol/L 作為IPTG 最優誘導濃度。

圖5 pET28a-CmCAT-DH5α PCR 檢測Figure 5 PCR detection of pET28a-CmCAT-DH5α

圖6 pET28a-CmCAT 雙酶切鑒定Figure 6 Double enzyme identification of pET28a-CmCAT

使用上述最優表達條件（37 ℃、0.2 mmol/L IPTG），對pET28a-CmCAT-BL21（DE3）最優表達時間進行進一步優化。將OD600 值為0.6～0.8 區間的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）菌液在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG 下進行不同時間的誘導（分別為誘導1、2、3、4、5、6 h）。從圖8中可以看出，隨著誘導時間的增加，目的蛋白的量也在逐漸增加，誘導6 h 獲得的目的蛋白量最大。而對照中載體與pET28a-CmCATBL21（DE3）未誘導均未有目的蛋白出現。因此，以誘導6 h 作為pET28a-CmCAT-BL21（DE3）在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG 下最優誘導時間長度。

最后對pET28a-CmCAT-BL21（DE3）進行不同溫度（25 ℃、30 ℃、37 ℃）誘導，同時檢測表達的目的蛋白的可溶性。SDS-PAGE 蛋白電泳分析顯示，3個溫度下均有大量目的蛋白出現，且對照無此條帶（見圖9），在30 ℃下誘導獲得的目的蛋白最為豐富。在上清中無明顯目的蛋白出現，其主要以包涵體的形式存在。

圖7 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）誘導濃度優化Figure 7 Concentration optimization of pET28a-CmCATBL21（DE3） IPTG induction

圖8 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）誘導時間優化Figure 8 Induction time optimization of pET28a-CmCATBL21（DE3）

圖9 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）誘導溫度優化及可溶性檢測Figure 9 Optimization of the induction temperature of pET28a-CmCAT-BL21（DE3）and its solubility detection

3 討論與結論

植物中復合抗氧化防御體系主要由抗氧化酶組成。其中，CAT 是第一個被發現和描述的[12]。植物遭受病原微生物侵染后會產生大量的H2O2[19]，而H2O2的積累會對植物組織、細胞產生巨大的傷害。CAT 對H2O2具有較高的親和性[20]，能有效清除過多的H2O2，在防御逆境脅迫和維持植物細胞氧化還原平衡方面具有重要的意義[21]。通過RT-PCR 方法，成功克隆出板栗CmCAT 基因，該基因全長1 479 bp，為一個完整的ORF，編碼492 個氨基酸。Blast 分析表明，CmCAT 基因核苷酸序列及氨基酸序列與其他植物的CAT 基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性分別在77%和82%以上，顯示其較高的保守性。Motif Scan 分析顯示，CmCAT 蛋白序列具有CAT 蛋白家族的catalase 結構域，同時還具有該蛋白家族2個保守的功能位點：過氧化氫酶近端活性位點和過氧化物酶近血紅素位點。分析板栗CmCAT 蛋白序列與其他23 個物種CAT 蛋白序列之間的進化關系，發現草本植物和木本植物分為兩個大的分支，其中板栗與核桃的親緣關系最近，與葫蘆科草本植物親緣關系最遠。

利用基因工程技術成功獲得pET28a-CmCAT重組載體，并轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG 誘導后獲得分子量約為60 kDa 的目的條帶，比預測的CmCAT 蛋白分子量（56.883 kDa）略大，pET28a 載體自帶的His-tag 標簽序列是造成這種偏差的主要原因之一[22]，同時，誘導獲得的目的蛋白與大豆GmCAT 基因在大腸桿菌中表達的融合蛋白分子量大小（60 kDa）一致[23]。隨后從IPTG 濃度、誘導時間及誘導溫度方面進行最優誘導條件的篩選，以期獲得更大量的目的蛋白。通過SDS-PAGE 電泳分析發現，30 ℃，0.2 mmol/L IPTG 誘導表達菌株6 h 獲得的目的蛋白量最大，但主要以包涵體的形式存在，且在誘導溫度降低的條件下（25℃）仍為包涵體。大腸桿菌已經成功地用于表達來自細菌和低等真核生物的活性重組CAT[24]。然而，利用大腸桿菌系統尚未得到可溶性植物CAT 重組蛋白[25]。陳金峰等[23]將大豆3 個CAT 基因連接pET28a 載體后，轉入大腸桿菌進行融合表達，獲得的融合蛋白也均為包涵體。彭丹等[26]發現，鹽穗木CAT 基因在BL21（DE3）中，通過低溫誘導能獲得可溶性的目的蛋白，但表達量較低。其所用的表達載體為pET32a，可能對植物CAT 基因在大腸桿菌中的可溶性表達具有一定的促進作用。N.Engel 等[25]發現，昆蟲細胞系能夠作為獲得植物來源的活性重組CAT 的替代方法。作為真核生物，昆蟲細胞系在遺傳上更相容，可以提供足夠的蛋白質折疊機器（分子伴侶）的支持，以及足夠的血紅素代謝池，并入新合成的重組血紅素蛋白。

本研究成功從板栗中克隆了一個CAT 基因，通過多種生物信息學軟件分析了CmCAT 基因的同源性、蛋白結構以及分子進化等相關信息，初步分析了CmCAT 基因在不同條件下的原核表達情況，為深入研究CmCAT 基因的功能和揭示板栗抗病過程中的分子機制奠定了基礎。