熒光法快速測定水中糞大腸菌群

由希華，徐 標，李恒慶，宗雪梅

山東省環境監測中心站，山東 濟南 250101

糞大腸菌群，是指一群能在(44.5±0.5)℃ 溫度下生長，發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，國外又稱耐熱大腸菌群。主要來源于人畜糞便，可導致腸道傳染病傳播[1]。水源水一旦被糞便污染，就存在腸道病原菌污染引起腸道傳染病甚至流行病的可能。因此，糞大腸菌群的檢測可準確及時地監控水源水受糞便污染的狀況，為相關部門有效預報和控制流行疾病的發生與傳播提供重要依據。

目前，國內外糞大腸菌群的檢測方法可分為多管發酵法、快速紙片法、濾膜法、酶底物法、熒光原位雜交(FISH) 技術、PCR 技術等[1-3]。國內糞大腸菌群監測方法主要有濾膜法、多管發酵法，并且這2種方法均屬于國標方法[4]，被國內環境監測部門廣泛采用。這2種方法分析成本低，結果較準確，但是操作繁瑣，需專業人員嚴格控制無菌條件，操作時間長(至少需要48 h)，并需要驗證試驗，不能快速對水的衛生狀況作出評價[3]，不適合應急現場監測。因此，采用更為快速、簡便、精確的監測方法顯得尤為重要。熒光法可以彌補傳統方法的不足，無需專業技術人員和嚴格無菌條件，無需驗證試驗。熒光法操作簡單，一般人員經過簡單培訓即可在現場完成操作，并且測定范圍廣，無需稀釋，測定范圍可達108MPN/100 mL，消除了人為帶入的誤差。全自動微生物監測儀可獨立自動完成培養、測試、結果判讀、發送報告等工作，故不受場地限制，可直接應用于現場監測。監測時間為動態時間，與待測樣本中目標細菌的濃度有關，濃度越高，檢測時間越短，最快可2 h內給出陽性測試報告，最長需要18 h。并可在第一時間將測試報告發送到指定郵箱，更適合應用于應急現場監測，做到早期預警，防止進一步危害的發生。

2010年，加拿大皇后大學研究人員和加拿大水質專家組成科研團隊，提出使用聚合物光學傳感器檢測同類型微生物熒光指標的方法。該方法目前已經在全球十余個國家和地區得到廣泛應用，并獲得多個權威部門的認證，這些部門包括中國環境監測總站、中國疾病預防控制中心、美國環保署、AOAC協會、新西蘭衛生部、菲律賓衛生部等。

1 實驗部分

1.1 儀器設備及試劑

實驗所用儀器和設備主要有微生物快速測定儀、培養箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、天平、采樣瓶等。

實驗試劑包括：糞大腸檢測試劑套筒(以下簡稱FCA套筒)、乳糖蛋白胨培養液、EC培養基、伊紅美藍瓊脂、硫代硫酸鈉溶液、無菌水等。

1.2 反應原理

將一定量的水樣與培養基混合均勻放置于44.5 ℃溫度下培養，糞大腸菌群在選擇性培養基上產生β-半乳糖苷酶，并分解熒光底物釋放出熒光產物(疏水)。熒光產物逃離水樣聚合至光學檢測區，通過光度計測定，依據熒光強度與水中糞大腸菌群數成一定關系的原理，建立數學模型，從而得出糞大腸菌群的濃度。

1.3 實驗方法

打開電源開關，設置添加樣品，錄入樣品編號，選擇TECTA-FCA-FC選項，點擊“ADD”，設置完成。將注入100 mL水樣的FCA套筒放入指定檢測池。關閉上蓋，儀器開始自動檢測。當儀器檢測到糞大腸菌群，自動檢測停止，并報告檢測數據。

2 結果與討論

2.1 準確度的測定

微生物檢測數據為偏態分布，按其統計分析要求，檢測所得結果全部經對數(以10為底)轉換后，再進行精密度與準確度的統計分析。

采用有證標準物質美國IDEXX糞大腸菌群標準菌株(NCTC 9001)驗證方法準確性，標準菌株濃度為653MPN/100 mL(65～1 350MPN/100 mL)。

將無菌水加入FCA套筒中，并定容至100 mL。將標準菌株加入套筒中，蓋緊上蓋，搖勻。放入微生物檢測儀中檢測。

在6家實驗室對標準菌株進行測定，每家實驗室平行測定6次，測試結果見表1。

表1 標準菌株測試結果Table 1 Standard strain testing results MPN/L

對實驗室數據進行匯總統計分析，計算實驗室內相對誤差，以計算熒光法的準確度。結果表明：6家實驗室平行測定結果均在標準菌株濃度(65～1 350MPN/100 mL)誤差范圍內，實驗室內相對誤差為-2.75%～1.71%，準確度較高。

2.2 精密度測定

實驗室精密度的研究需要采集高(4.6×107MPN/L)、中(4.6×105MPN/L)、低(4.6×103MPN/L)3個不同濃度水平實際水樣進行測試，在6家實驗室中每家實驗室平行測定6次。

將待測水樣加入FCA套筒中，并定容至100 mL。蓋緊上蓋，搖勻，放入微生物檢測儀中檢測，測試結果見表2～表7。

表2 1號實驗室實際水樣精密度測試數據Table 2 No.1 laboratory regular water sample precision test data

注：i為實驗次數，S和RSD為原始數據以10為底，對數轉化后計算所得，下同。

表3 2號實驗室實際水樣精密度測試數據Table 3 No.2 laboratory regular water sample precision test data

表4 3號實驗室實際水樣精密度測試數據Table 4 No.3 laboratory regular water sample precision test data

表5 4號實驗室實際水樣精密度測試數據Table 5 No.4 laboratory regular water sample precision test data

表6 5號實驗室實際水樣精密度測試數據Table 6 No.5 laboratory regular water sample precision test data

表7 6號實驗室實際水樣精密度測試數據Table 7 No.6 laboratory regular water sample precision test data

對實驗室的數據進行匯總統計分析，計算實驗室內精密度，以實驗室內和實驗室間相對偏差表示[5]。監測結果表明：6家實驗室內的相對標準偏差范圍分別為1.30%～3.93%、1.94%～4.72%、1.88%～4.54%，實驗室間的相對標準偏差分別為1.14%、1.59%、1.72%，精密度較高。

2.3 熒光法與多管發酵法相關性實驗

選擇不同的地表水、廢水樣品進行熒光法與多管發酵法比對測試[6-9]，討論方法適用性。實驗中采用38份地表水及污水水樣進行糞大腸菌群的監測，多管發酵法所用培養基、試劑和測定方法參照《水質 糞大腸菌群的測定 多管發酵法和濾膜法(試行)》[4]的相關要求，熒光法操作步驟同上，熒光法和多管發酵法測糞大腸菌群的線性回歸分析見圖1。相關系數(r)為0.984 4，標準化系數為0.984，回歸系數(B)為1.077，表明熒光法與多管發酵法結果之間有顯著的線性相關關系。

圖1 2種方法測定結果變化趨勢Fig.1 The tendency chart of the ammonium determined by the methods

對2種方法檢測的糞大腸菌群結果進行配對t檢驗[10-11]，用來檢驗2種方法測定結果的差異性，統計結果表明，2種方法無顯著差異。結果見表8。

表8 熒光法和多管發酵法t檢驗結果Table 8 Results of t test by fluorescence and multi-tube method

3 結論

精密度和準確度實驗表明，熒光法測定糞大腸菌群具有較高精密度和準確度；熒光法和多管發酵法相關性實驗表明，2種方法在測定結果一致性、相關性等方面沒有顯著差異，初步認為熒光法可應用于地表水和廢水中糞大腸菌群的檢測。

熒光法相比于傳統多管發酵法具有明顯優點，操作簡單，監測時間短，可在現場直接監測，測定范圍廣，可同時測定多個樣品，能快速判斷水樣的微生物污染狀況，尤其適用于應急現場監測，可應用于地表水、廢水中的糞大腸菌群檢測。