鄂西南地區(qū)稻瘟病菌最適生長培養(yǎng)基篩選

鄭潔 安樂 鄧森文 黎艷艷 王春臺 徐鑫

摘要[目的]篩選鄂西南地區(qū)稻瘟病菌的最適生長培養(yǎng)基。[方法]從鄂西南地區(qū)稻瘟病菌生理小種文庫中選擇優(yōu)勢菌株，在米糠培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基，以及以上3種材料按比例混配的4種組合培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長狀態(tài)。[結(jié)果]同種菌株在不同培養(yǎng)基上生長速率不同，不同菌株在同一種培養(yǎng)基上生長速率不同，在含有米糠、燕麥、馬鈴薯3種成分的M7培養(yǎng)基上稻瘟菌生長量最大。[結(jié)論]M7培養(yǎng)基為鄂西南地區(qū)稻瘟菌的最適生長培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞稻瘟病菌;生長速率;培養(yǎng)基;鄂西南地區(qū)

中圖分類號S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0127-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.039

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

稻瘟病由稻梨孢菌（Magnaportheoryzae）所引起，每年由稻瘟病菌導(dǎo)致的稻瘟病減產(chǎn)的水稻總量相當(dāng)于6000萬人口的年糧食需求量[1]。武陵山區(qū)地屬亞熱帶季風(fēng)性山地濕潤氣候，雨熱同季，降水充沛，導(dǎo)致該地區(qū)經(jīng)常暴發(fā)稻瘟病[2-3]，且其境內(nèi)地形地貌復(fù)雜多樣，海拔高低懸殊，水稻種植的品種和時間具有顯著差異，導(dǎo)致該地區(qū)的稻瘟病菌生理小種品種十分豐富[4]。

病原菌與作物之間存在互作，通過研究稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)及遺傳變異信息，有助于指導(dǎo)開展抗瘟育種和合理利用抗性，延長品種的抗病使用年限[5]。近年來，對稻瘟病菌遺傳多樣性的研究在全國各地越來越普遍。研究表明，鄂西南地區(qū)稻瘟病菌生理小種[6]的優(yōu)勢群體與黑龍江[7]、湖南[8]、貴州[9]等地有較大差別。不同的稻瘟病菌生理小種，適合的培養(yǎng)基可能不同[10]，常用的配制方便且價格經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基包括燕麥片培養(yǎng)基[6，11]、米糠培養(yǎng)基[12-13]和PDA培養(yǎng)基[14]等。筆者選取上述3種培養(yǎng)基以及各組分混配的組合培養(yǎng)基進(jìn)行稻瘟病菌不同生理小種最適生長培養(yǎng)基的篩選試驗，明確鄂西南地區(qū)水稻稻瘟病菌優(yōu)勢種群的最適培養(yǎng)條件，旨在為該地區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性研究及水稻抗病品種的選育提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。

所用稻瘟病菌生理小種B31-2及B6-5[6]由武漢中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室/生物技術(shù)國家民委重點實驗室提供。

1.1.2供試培養(yǎng)基。

M1：米糠20g，清水1000mL，瓊脂20g;M2：燕麥片30g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M3：切塊馬鈴薯200g，清水1000mL，葡萄糖20g，瓊脂18g;M4：切塊馬鈴薯100g，燕麥片15g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M5：切塊馬鈴薯100g，米糠10g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M6：燕麥片15g，米糠10g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M7：切塊馬鈴薯70g，燕麥片15g，米糠10g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g。

1.2方法

1.2.1稻瘟病菌活化。

從保存菌種B31-2和B6-5的濾紙條上剪下一小片置于燕麥培養(yǎng)基中心，將提前準(zhǔn)備好的直徑6mm的滅菌圓形濾紙片以菌株為中心呈包圍狀置于培養(yǎng)基表面，27℃培養(yǎng)7d左右，至菌絲長滿濾紙片。

1.2.2稻瘟病菌培養(yǎng)。

取長滿菌絲的濾紙圓片分別置于7種培養(yǎng)基中心，27℃培養(yǎng)，分別在第3、5、7天時采用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速度，重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行比較。于培養(yǎng)第7天拍照記錄菌落形態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1同一菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

通過對稻瘟病菌生長第7天的菌落形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)不同稻瘟病菌生理小種在相同培養(yǎng)基上具有相似的菌落形態(tài)，而同一稻瘟病菌生理小種在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)差異較大，與許鳴一[10]的研究結(jié)果一致。由圖1可知，稻瘟菌在M1培養(yǎng)基上菌體呈淺褐色，表面平整，菌落中部有少數(shù)白色氣生菌絲;在M2培養(yǎng)基上呈深黑色，表面平整，菌落中心有極少數(shù)白色氣生菌絲;在M3培養(yǎng)基上菌體呈灰綠色，表面有褶皺，菌落中心及邊緣有白色氣生菌絲，且菌落邊緣呈羽毛狀;在M4培養(yǎng)基上菌體呈淺灰色，表面褶皺明顯，中心聚集灰色菌絲，邊緣有灰白色菌絲均勻且密集分布;在M5培養(yǎng)基表面菌體為淡灰色，表面有較深放射狀褶皺，菌落邊緣遍布白色菌絲;在M6培養(yǎng)基表面菌體為墨綠色，表面平整，覆有豐富灰色菌絲;在M7培養(yǎng)基表面菌體為淺灰色，表面有褶皺，菌落邊緣不整齊，為淡綠色點狀分布，并伴有少數(shù)白色菌絲。

2.2不同菌株在不同培養(yǎng)基上的生長量變化

由圖2和3可知，在不同培養(yǎng)基上，不同菌株的生長曲線均呈快速線性增長。由圖4、5可知，在不同培養(yǎng)基上，同一種菌株的生長速率不一致。不同種菌株在同一種培養(yǎng)基上生長速率也不一致。菌株B6-5在M1～M77種培養(yǎng)基上生長7d的直徑分別為3.92、4.49、4.74、4.84、4.90、4.86、5.04cm。菌株B31-2在7種培養(yǎng)基上生長7d的直徑分別為3.87、4.21、4.11、4.45、4.69、4.52、4.90cm。

分別取培養(yǎng)3、5、7d的原始數(shù)據(jù)減去平均數(shù)，得到同一菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)不同時間的相對菌落直徑，采用F檢驗[15]的方法對其進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，不同菌株在不同培養(yǎng)基中的生長量存在顯著差異。差異顯著性測驗結(jié)果表明，培養(yǎng)3d時，相同菌株在7種不同培養(yǎng)基上生長量不存在顯著差異，培養(yǎng)5和7d時，相同菌株在7種不同培養(yǎng)基上生長量存在顯著差異。由于稻瘟病菌培養(yǎng)一般在7d以上，在培養(yǎng)7d時，不同菌株和不同培養(yǎng)基間具有顯著差異，由此可知，鄂西南地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種在M7培養(yǎng)基上稻瘟菌生長速率最大。

3結(jié)論與討論

該研究選取較為經(jīng)濟(jì)及廣泛使用的3種培養(yǎng)基（米糠培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基以及馬鈴薯培養(yǎng)基）及3種成分按比例混合的組合培養(yǎng)基進(jìn)行了試驗，將鄂西南地區(qū)優(yōu)勢菌株B31-2及B6-5在7種培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的菌落直徑進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鄂西南地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種在7種培養(yǎng)基上生長速率最快的為M7培養(yǎng)基，其次是M4～M6培養(yǎng)基，而在M1～M3培養(yǎng)基上生長速率均比組合培養(yǎng)基慢。由此可知，米糠、燕麥、馬鈴薯這3種成分的存在協(xié)同促進(jìn)稻瘟病菌菌絲的生長。

與許鳴一[10]的研究結(jié)果一致，菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上的生長速率大于米糠培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基，這可能是由于PDA中含氮量高，導(dǎo)致菌株生長速率較快。吳斯駿等[16]使用江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的菌株群體ZB13進(jìn)行試驗，配制出了一種新型的稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基（秸稈浸出液：PDA=1∶1，V/V）。該研究選用的材料經(jīng)濟(jì)成本相對較高。后續(xù)可將秸稈浸出液這一成本經(jīng)濟(jì)、來源便捷的材料加入試驗，觀察含有4種成分的培養(yǎng)基對稻瘟病菌生長是否具有促進(jìn)作用。

稻瘟病菌的生長速率與產(chǎn)孢能力不呈正相關(guān)。孫國昌等[17]研究表明，米糠培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量弱于玉米粉稻稈瓊脂

培養(yǎng)基，與其不一致的是，蘭波等[12]研究表明，稻瘟病菌在

米糠培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大。該差異可能與使用的供試菌株不同有關(guān)。該研究選用的菌株為2012年從鄂西南地區(qū)感

病稻稈上分離得到的野生菌株，與前人進(jìn)行試驗的菌株有差別，因此，選取鄂西南地區(qū)優(yōu)勢菌株對M7培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢量的分析很有必要。

為了進(jìn)一步對M7培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，主要從以下3個方面進(jìn)行改進(jìn)和完善：加大供試菌株數(shù)目，并選取不同年間的優(yōu)勢菌株進(jìn)行試驗;進(jìn)行正交試驗，得到4種成分的最佳配比;進(jìn)行產(chǎn)孢試驗并做活體接種觀察其孢子致病性，在最適生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上篩選最優(yōu)產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

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